家族性乳癌原因遺伝子Brca2の欠損細胞株作成によるBrca2の機能解析-乳癌由来変異Brca2分子の機能評価システムの構築-

様々な状況証拠から、BRCA2の変異によってHRの異常が起こっていることが推定されている。本研究ではまず、ニワトリBRCA2の全長cDNAのクローニングを行った。ヒトBRCA2の部分配列をプローブとしてストリンジェンシーを下げたハイブリでニワトリライブラリーをスクリーニングし、N末、C末のcDNAクローンを得た。さらにその中間に6kb程度の不明部分があったので、そこはN末、C末の既知配列からプライマーをデザインしてPCRし、ニワトリcDNAの中間部分を得た。現在ドラフトシーケンスは終了し、さらに確認のシーケンスを行っている。ヒトのBRCA2とはかなりダイバージした部分、良く保存された部分も見られ、機能上重要な部分が浮かび上がってきそうである。さらに、ゲノムクローンを分離し、ターゲティングベクターを作成し、DT40にトランスフエクトしてクロンをサザンで選別し、ヘテロのクローンを得た。このヘテロヒトBRCA2を発現させてウェスタンを行って確認しようとしている。BRCA2が巨大なタンパクであるためか、ウェスタンブロットがなかなか成功しない。現在Inducible Cre recombinaseの使用も検討中である。

様々な状況証拠から、BRCA2の変異によってHRの異常が起こっていることが推定されている。本研究ではまず、ニワトリBRCA2の全長cDNAのクローニングを行った。ヒトBRCA2の部分配列をプローブとしてストリンジェンシーを下げたハイブリでニワトリライブラリーをスクリーニングし、N末、C末のcDNAクローンを得た。さらにその中間に6kb程度の不明部分があったので、そこはN末、C末の既知配列からプライマーをデザインしてPCRし、ニワトリcDNAの中間部分を得た。現在ドラフトシーケンスは終了し、さらに確認のシーケンスを行っている。ヒトのBRCA2とはかなりダイバージした部分、良く保存された部分も見られ、機能上重要な部分が浮かび上がってきそうである。さらに、ゲノムクローンを分離し、ターゲティングベクターを作成し、DT40にトランスフエクトしてクロンをサザンで選別し、ヘテロのクローンを得た。このヘテロヒトBRCA2を発現させてウェスタンを行って確認しようとしている。BRCA2が巨大なタンパクであるためか、ウェスタンブロットがなかなか成功しない。現在Inducible Cre recombinaseの使用も検討中である。