枯草菌のホリデイ構造特異的なエンドヌクレアーゼのクローニングと機能解析

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本研究の目的は枯草菌の相同組換えの後期過程、すなわちホリデイ構造に特異的に働く種々の酵素をクローニングし、その機能をin vivo,in vitroで解明することにある。特にホリデイ構造に特異的に働く大腸菌のエンドヌクレアーゼRuvCに相当する枯草菌のエンドヌクレアーゼの検索を研究目的とした。ホリデイ構造に特異的に働く大腸菌のRuvABCと相同性の高い蛋白質を枯草菌の全ゲノム配列から検索した。RuvABと相同性の高い遺伝子は存在したが、RuvCに相当する遺伝子は発見できなかった。大腸菌でRuvABCが協同的に働いていることから、枯草菌にもRuvCの役割を担うホリデイ構造特異的エンドヌクレアーゼがあると考えた。枯草菌のruvAおよびruvB挿入失活株を作成した。LB液体培養においてruvABは隣接する二つのtRNA関連遺伝子、一つの機能未知の遺伝子とともにポリシストロニックに対数増殖期に転写されていた。またRuvAとRuvBはともに対数増殖期に発現していることを挿入失活に用いたDNA上にあるlacZのβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することによって明らかにした。また、ruvAおよびruvB挿入失活株はともにマイトマイシンCに対して感受性になった。RuvABにはヌクレアーゼ活性がないことを考えるとRuvC様ヌクレアーゼが存在するものと思われるが現在のところ検索方法を検討中である。大腸菌のホリデイ構造特異的エンドヌクレアーゼRusAと相同性が高い枯草菌のYqaN蛋白もRuvC様酵素の一つの候補であると考え、発現用プラスミドDNAを構築した。大腸菌で大量発現させ、現在ほぼ単一になるところまで精製した。今後は精製した酵素を用いて枯草菌RusA(YqaN)の機能を解析するとともに、他にRuvC様酵素がないかどうかを調べていく。