アカパンカビのDNA除去修復機構の解明

アカパンカビのflap endonucleaseホモログ遺伝子は、394アミノ酸からなる分子量45kDのタンパク質をコードしており、1,185baseのORFからなり、途中3つのイントロンによって寸断されている。この遺伝子はRFLPマッピングの結果、第VII連鎖群に存在するが詳細なマップは不明である。アカパンカビにおけるこの遺伝子の機能を知るためRIP(repeat induced point mutation)による遺伝子破壊を試みた。遺伝子破壊操作の後、子孫株の変異原感受性試験、温度感受性試験を試みたが感受性株は得られなかった。また、子孫株のゲノムDNAを抽出し制限酵素で切断し、泳動の後、サザンハイブリダイゼイションを行い、flap遺伝子の制限酵素部位に変異が生じているかどうかを調べたところ、変異を確認できなかった。二つの可能性が考えられた。すなわち(1)アカパンカビのflap遺伝子はessentialであるため、この遺伝子に変異を持つ株は回収できない。(2)この遺伝子はRIP抵抗性で、RIPによる遺伝子破壊はできない/できにくいDNA構造になっている。そこでessentialかどうかを見るために、flap遺伝子のアンチセンス遺伝子を作製し、これを細胞内で発現させ、本来の遺伝子の働きを停止させる実験を行った。また、シャドウRIPと呼ばれる方法でessentialか否かの確認実験を行った。DNA構造に関しては、種々の制限酵素による切断実験を行ったが、やはり構造に特徴があることが示唆された。

アカパンカビのflap endonucleaseホモログ遺伝子は、394アミノ酸からなる分子量45kDのタンパク質をコードしており、1,185baseのORFからなり、途中3つのイントロンによって寸断されている。この遺伝子はRFLPマッピングの結果、第VII連鎖群に存在するが詳細なマップは不明である。アカパンカビにおけるこの遺伝子の機能を知るためRIP(repeat induced point mutation)による遺伝子破壊を試みた。遺伝子破壊操作の後、子孫株の変異原感受性試験、温度感受性試験を試みたが感受性株は得られなかった。また、子孫株のゲノムDNAを抽出し制限酵素で切断し、泳動の後、サザンハイブリダイゼイションを行い、flap遺伝子の制限酵素部位に変異が生じているかどうかを調べたところ、変異を確認できなかった。二つの可能性が考えられた。すなわち(1)アカパンカビのflap遺伝子はessentialであるため、この遺伝子に変異を持つ株は回収できない。(2)この遺伝子はRIP抵抗性で、RIPによる遺伝子破壊はできない/できにくいDNA構造になっている。そこでessentialかどうかを見るために、flap遺伝子のアンチセンス遺伝子を作製し、これを細胞内で発現させ、本来の遺伝子の働きを停止させる実験を行った。また、シャドウRIPと呼ばれる方法でessentialか否かの確認実験を行った。DNA構造に関しては、種々の制限酵素による切断実験を行ったが、やはり構造に特徴があることが示唆された。