生物分子モーターダイニンの組み替えモーター領域の解析

生物分子运动动力蛋白重组运动区的分析

• 批准号: 11156223
• 负责人: 小川 和男
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11156223/
• 关键词: モーターたん白質; ダイニン; P-ループ; モーター領域; バキュロウイルス; ATPアーゼ活性

はじめに: 精子鞭毛の運動モーターであるダイニンは他の生物分子モーターであるミオシンやキネシンと比べて分子の大きさ、構成タンパク質の複雑性の点で極めて際立っている。ダイニン重鎖がモーター分子としての役割を担っているが、分子中に4つのATP結合配列が存在することも、1つのATP結合配列しか持たない他の分子モーターと区別される所以である。本研究ではウニ精子外腕ダイニン重鎖のcDNAをバキュロウイルス発現系に組み込み、発現タンパク質のATPase活性を測定することで、重鎖のATPase活性部位を同定することを目的にした。結果: ダイニン重鎖は単独で発現させても不溶性タンパク質となり生理活性は測定できなかった。in situでは重鎖は中間鎖1と複合体を形成しており、中間鎖1にはthioredoxin様活性があり、重鎖タンパク質のfoldingに寄与している可能性があったので、発現に際しては、重鎖断片と中間鎖1とのdual expressionを行い、可溶化を試みた。1.バキュロウイルス発現系ではダイニン重鎖(〜500kDa)の全長を発現させることはできたが、発現量は少なかった。中間鎖1と一緒に発現させることでその一部が可溶化されたが、ATPase活性は検出されなかった。想定される重鎖モーター領域(〜400kDa)は分子のC端末側2/3に相当し、dual expressionでその一部が可溶化されたが、ATPase活性は検出できなかった。発現量は依然として僅かであった。2.4つのP-loopをカバーするM領域(〜200kDa)では発現量は顕著であったが可溶化されたのは依然として一部であった。ATPase活性は極僅かではあったが検出された。3. 4つのP-loopをN末端側からP1、P2、P3、P4と呼ぶことにする。各発現断片に一つだけP-loopを含ませるようにさせる。いずれも発現タンパク質の一部のみが可溶化されるだけであったが、ATPase活性はわずかながらP1部位を含む断片のみにあった。他のP-loop配列を含む断片では検出されなかった。考察: 軸糸ダイニンおよびその断片は単独の発現では可溶化されなかったが、thioredoxin様活性をもつ中間鎖1とのdual expressionによってその一部が可溶化できるようになった。ATPase活性は発現タンパク質が大きいと検出されなかったが200kDa以下になると検出されるようになった。このことは分子が大きいとタンパク質のfoldingが正しく行われない可能性があることを示唆している。ATPase活性に関するのは4つのうち最初の配列だけとの結論が出された。Dual expressionによって発現タンパク質の可溶化の度合いはある程度改善されたが、それでも極僅かであった。タンパク質濃度に比べて低いATPase活性は、タンパク質のfoldingが完全にうまくいっていない可能性があり、今後の検討課題である。

は じ め に : sperm flagella の sports モ ー タ ー で あ る ダ イ ニ ン は he の biomolecular モ ー タ ー で あ る ミ オ シ ン や キ ネ シ ン と than べ て large molecular の き さ, composition タ ン パ ク qualitative の complex 雑 の point で extremely め the interstate 35 w set っ て て い る. ダ イ ニ ン heavy lock が モ ー タ ー molecular と し て の "を cut bear っ て い る が, molecular に 4 つ の ATP combined with column が exist す る こ と も, 1 つ の ATP combined with column し か hold た な い he の molecular モ ー タ ー と difference さ れ る so で あ る. This study で は ウ ニ sperm outside wrist ダ イ ニ ン heavy lock の cDNA を バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 発 now is に group み 込 み, 発 タ ン パ ク qualitative の を ATPase activity determination す る こ と で, heavy lock の を ATPase activity of parts with fixed す る こ と を purpose に し た. Results: ダ イ ニ ン heavy lock は 単 alone で 発 now さ せ て も insoluble タ ン パ ク qualitative と な り physiological activity determination of は で き な か っ た. The in situ で は heavy locked は intermediate 1 と complex を form し て お り, intermediate lock 1 に は thioredoxin others active が あ り, heavy lock タ ン パ ク qualitative の folding に send し て い る possibility が あ っ た の で, 発 now に interstate し て は, heavy lock fragment と intermediate 1 lock と の dual expressionを line を soluble を test みた. 1. バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 発 now is で は ダ イ ニ ン heavy lock (~ 500 kda) over の を 発 now さ せ る こ と は で き た が, 発 now fewer は な か っ た. The middle と lock 1 mio に 発 now さ せ る こ と で そ の a が solubilization さ れ た が, ATPase activity は 検 out さ れ な か っ た. Scenarios さ れ る heavy lock モ ー タ ー areas (~ 400 kda) molecular の は C end side two-thirds に quite し, dual expression で そ の a が solubilization さ れ た が, ATPase activity は 検 out で き な か っ た. The occurrence volume is still と て て only であった であった. 2.4 つ の P - loop を カ バ ー す る M field (~ 200 kda) で は 発 now quantity は 顕 the で あ っ た が solubilization さ れ た の は still と し て a で あ っ た. ATPase activity <s:1> is extremely limited to された で あったが検 あったが検 あったが検 された. 3.4 を <s:1> P-loopを n-terminal side らP1, P2, P3, P4と call ぶ とにする とにする. Each occurs a fragment に one だけP-loopを containing ませるようにさせる. い ず れ も 発 now タ ン パ ク qualitative の a の み が solubilization さ れ る だ け で あ っ た が, ATPase activity は わ ず か な が ら を P1 parts including む fragment の み に あ っ た. He <s:1> P-loop sequences を containing む fragments で 検 検 out されな った った った. Inspection: shaft si ダ イ ニ ン お よ び そ の fragment は 単 alone の 発 now で は solubilization さ れ な か っ た が, thioredoxin others active を も つ intermediate 1 lock と の dual expression に よ っ て そ の a が solubilization で き る よ う に な っ た. ATPase activity は 発 now タ ン パ ク qualitative が big き い と 検 out さ れ な か っ た が below 200 kda に な る と 検 out さ れ る よ う に な っ た. こ の こ と は large molecular が き い と タ ン パ ク qualitative の folding が is し く line わ れ な い possibility が あ る こ と を in stopping し て い る. The activity of ATPase is に related to する <s:1> だけと 4 うち うち the initial <s:1> configuration だけと the conclusion が leads to された. Dual expression に よ っ て 発 now タ ン パ ク qualitative の solubilization の degrees or い は あ る extent improve さ れ た が, そ れ で も pole only か で あ っ た. タ ン パ ク に mass concentration than べ て low い は ATPase activity, タ ン パ ク qualitative の folding が completely に う ま く い っ て い な い possibility が あ り, future の 検 for subject で あ る.