蛋白高次構造解析に向けた新規大量発現系の構築

新型大规模蛋白质构象分析表达系统的构建

• 批准号: 11160221
• 负责人: 星川 裕
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11160221/
• 关键词: 立体構造; 蛋白大量発現; バキュロウイルス; アデノウイルス; HIF; T7polymerase; 分泌; 培養方法

蛋白の立体構造を解き明かすためには十分な質と量の確保が最も困難でかつ重要なステップである。しかし、これまでに確立された様々な方法は蛋白が本来とどめなかったり、あるいは汎用性に乏しかったりした。そこで我々は比較的簡単でかつ汎用性に富む新規蛋白発現系を昆虫細胞や動物細胞を用いて構築する試みを行っている。1)Sf9/バキュウロウイルスベクターを用いた系我々はこれまでにバキュウロウイルスベクターに改変を加え、細胞外に積極的に分泌させる系の構築を行った。分泌シグナルとしてハチ毒素melitinの分泌シグナルを加え、これまでにまだ構造の分かっていない転写因子HIF(Hypoxia Inducible Factor)のC末を題材に選んで大量産生を試みている。しかし、現在の段階ではある程度の発現は見られるものの構造解析に十分な量の確保には至っていない。そこで転写レベルでの向上を目的として、T7polymerase遺伝子のクローニングを行い、これらを組み込むことにより転写レベルを向上させることによる蛋白発現量の上昇を期待している。また、東北大学理学部高崎博士との共同研究により、Sf9/バキュウロウイルスベクターを用いた系(非分泌型)で転写因子ARNT産生を行い、試料の供与を行っているが、三角フラスコを用いた振とう培養で増殖可能なSf9細胞を選択したことにより、一度により大量の細胞の培養及び発現が可能となった。2)動物細胞/アデノウイルスベクターと用いた系これまでアデノウイルスを用いた系は非常に時間のかかる煩雑な系であった。そこでこの系をより短時間で簡便に利用可能とするための改変を行った。アデノウイルスの系は国立食品医薬衛生研究所の水口博士らにより、ウイルスゲノムを大腸菌で比較的容易に扱えるようになったが、我々はさらに改良を加えてrecombinase反応を行うことにより、one step動物細胞発現型プラスミドベクターから直接アデノウイルスに乗せ換えられるベクター系の構築を行った。このベクターには様々なプロモーターと分泌シグナルとを組み合わせて用いられる形にした。さらに現在、T7polymeraseを発現するアデノウイルスとの共感染を行うことによって、より大量の蛋白発現を期待している。また、ホスト細胞として、より大量に適した動物細胞の検索を行う予定である。現在上記の系の汎用についてしらべるとともに国立奈良先端科学技術大学院大学武内先生らと共にベクター構築・細胞の問題点の解決を行っている。

The three-dimensional structure of protein is very difficult to understand and ensure. The method is to establish the original protein, and the method is to establish the universal protein. This is the first time that we have tried to construct a novel protein development system in insect cells and animal cells. 1) Sf9/Sf9 Secretion of melitin-like substances is a major factor in the production of HIF(Hypoxia Inducible Factor). The degree of occurrence of the present stage is determined by the structural analysis of the present stage. The increase in protein production is expected to be due to the increase in protein production in the T7polymerase gene chain reaction. In the joint research conducted by Dr. Takasaki, Faculty of Science, Tohoku University, Sf9 cells can be cultured and developed in large numbers of cells in vitro. 2)Animal cells/cells This system is easy to use in a short time. It is easy to compare Escherichia coli and improve the recombinant enzyme reaction. It is easy to construct the animal cell development system by one step. This is the first time that I've ever seen a woman who's had sex with someone else. In addition, T7polymerase is expected to produce a large number of proteins. A large number of animal cells were detected. Now the system of general use of

项目成果

Mori, A., Higashi, H., Hoshikawa, Y., Imamura, M., Asaka, M., Hatakeyama, M.: "Granulocytic differentiation of myeloid progenitor cells by p130, the retinoblastoma tumor suppressor homologue."Oncogene.. 18. 6209-6221 (1999)

Mori, A.、Higashi, H.、Hoshikawa, Y.、Imamura, M.、Asaka, M.、Hatakeyama, M.：“p130（视网膜母细胞瘤肿瘤抑制同源物）对骨髓祖细胞的粒细胞分化。”癌基因..

T.Yoshizawa, Y.Yamagishi, N.Koseki, J.Goto, H.Yoshida, F.Shibasaki, S.Shoji andI.Kanazawa: "Cell cycle arrest enhances the in vitro cellular toxicity of the truncated Machado-Joseph disease gene produdt with an expanded polyglutamine stretch"Human Molecul

T.Yoshizawa、Y.Yamagishi、N.Koseki、J.Goto、H.Yoshida、F.Shibasaki、S.Shoji 和 I.Kanazawa：“细胞周期停滞增强了截短的马查多-约瑟夫病基因产物的体外细胞毒性”

Wang, H-G., Pathan, N., Ethel, I.M., Krajewski, S., Yamaguchi, Y., Shibasaki, F.,: "Ca^<2+>-induced apoptosis through calcineurin dephosporylation of BAD"Science. 284. 339-343 (1999)

Wang，H-G.，Pathan，N.，Ethel，I.M.，Krajewski，S.，Yamaguchi，Y.，Shibasaki，F.，：“Ca ^ 2 -通过BAD的钙调神经磷酸酶去磷酸化诱导细胞凋亡”科学。

下重美紀,芝崎 太: "カルニューリンを介するアポトーシス制御"実験医学 増刊 脳・神経科学の最先端. 17. 92-99 (1999)

Miki Shimoshige、Futoshi Shibasaki：“钙神经素介导的细胞凋亡控制”实验医学特刊：脑和神经科学前沿 17. 92-99 (1999)。

Omori, N., Hoshikawa, Y., Uchino, H., Shibasaki, F.: "Nuclear Factor of Activated T Cells(NFAT)/Calcineurin Pathway in Microglia"Neurochemical Research. (in oress).

Omori, N.、Hoshikawa, Y.、Uchino, H.、Shibasaki, F.：“小胶质细胞中活化 T 细胞核因子 (NFAT)/钙调磷酸酶途径”神经化学研究。