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蛋白高次構造解析に向けた新規大量発現系の構築

新型大规模蛋白质构象分析表达系统的构建

基本信息

批准号：
12034222
负责人：
星川裕
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

われわれは機能遺伝子の検索から構造解析用の蛋白発現にいたるまで一貫して簡単に行えるような総合的な系の構築を目指し、アデノウイルスをベクターとして用いることにした。より簡便に用いるために、ファージ遺伝子の試験管内組み替えシステムを応用することで、アデノウイルスをベクターとするcDNA libraryの作製を可能とし、導入遺伝子の回収を容易に行える系を構築した。このような系を用いることにより、これまでに不可能だった実験動物や初代培養細胞などを用いた機能遺伝子の検索と同定が可能となり、より幅広い遺伝子の機能解析が可能になる。具体的にはプラスミドの形で増幅できるアデノベクターにλファージの組み換え配列であるattR配列を組み込んだDonor型VectorとattL配列とCMVプロモーターを有する導入用ベクターを構築した。このシステムではまず、そのままで動物細胞発現用ベクターとしても利用可能な導入用ベクターに目的の遺伝子あるいはlibraryを導入し、次いで試験管内でDonor型Vectorとrecombinaseを作用させることでAdeno Virus Vectorに容易にのせ換えることができ、この後ベクターを制限酵素で処理し、293細胞に導入するだけでウイルスの作製が可能であった。さらにこの組み換え反応が可逆的であることを利用して、感染細胞からの導入遺伝子の回収をPCRと逆反応を行うことで回収し、再びアデノウイルスに戻すことができる様条件検討を行っている。さらにアデノウイルスの種を越えた感染性と蛋白発現を高める改良を行うとともに大量発現に向けてT7ポリメラーゼ発現細胞の開発もおこなっている。現在、上記のシステムの安定性と効率を上げる検討とともにlibraryの作製を行っており、出来次第、転写因子や細胞死の調節因子などの同定を行う予定である。

The protein discovery for structural analysis is consistent with the construction of a complex protein system. It is easy to construct a cDNA library that can be used to construct a cDNA library in a simple way. The function analysis of the gene is possible in animals and primary culture cells. Specific types of vectors include attR, attL, CMV, etc., which are used for import. The Adeno Vector can be easily transformed into the Adeno Vector and can be used to control enzyme processing. The Adeno Vector can be introduced into 293 cells and can be used to control enzyme processing. In addition, the reverse transformation of the virus into the infected cells can be used to reverse the PCR process. The development of infectious proteins in the T7 cells was improved. Now, remember the stability of the system, the efficiency of the system, the stability of the system.