蛋白高次構造解析に向けた新規大量発現系の構築

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われわれは機能遺伝子の検索から構造解析用の蛋白発現にいたるまで一貫して簡単に行えるような総合的な系の構築を目指し、アデノウイルスをベクターとして用いることにした。より簡便に用いるために、ファージ遺伝子の試験管内組み替えシステムを応用することで、アデノウイルスをベクターとするcDNA libraryの作製を可能とし、導入遺伝子の回収を容易に行える系を構築した。このような系を用いることにより、これまでに不可能だった実験動物や初代培養細胞などを用いた機能遺伝子の検索と同定が可能となり、より幅広い遺伝子の機能解析が可能になる。具体的にはプラスミドの形で増幅できるアデノベクターにλファージの組み換え配列であるattR配列を組み込んだDonor型VectorとattL配列とCMVプロモーターを有する導入用ベクターを構築した。このシステムではまず、そのままで動物細胞発現用ベクターとしても利用可能な導入用ベクターに目的の遺伝子あるいはlibraryを導入し、次いで試験管内でDonor型Vectorとrecombinaseを作用させることでAdeno Virus Vectorに容易にのせ換えることができ、この後ベクターを制限酵素で処理し、293細胞に導入するだけでウイルスの作製が可能であった。さらにこの組み換え反応が可逆的であることを利用して、感染細胞からの導入遺伝子の回収をPCRと逆反応を行うことで回収し、再びアデノウイルスに戻すことができる様条件検討を行っている。さらにアデノウイルスの種を越えた感染性と蛋白発現を高める改良を行うとともに大量発現に向けてT7ポリメラーゼ発現細胞の開発もおこなっている。現在、上記のシステムの安定性と効率を上げる検討とともにlibraryの作製を行っており、出来次第、転写因子や細胞死の調節因子などの同定を行う予定である。