蛋白高次構造解析に向けた新規大量発現系の構築

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1)アデノウイルスを用いたcDNAライブラリーの構築ファージ遺伝子の組み換えシステムをアデノウイルス作製に応用することにより、容易に目的のウイルスの作製を可能とする系の開発を行った。具体的にはLiftech社のGatewayシステムをプラスミド型アデノウイルスベクターに組み込み、シャトルベクターのプロモーター領域には強力なCAGプロモーターを用いた。このシステムを用いることでコントロール遺伝子を容易にウイルスベクターに移し替えることが可能であった。しかし、このシステムではクローン遺伝子の載せ替えには有効であるが、ライブラリーのような遺伝子群の均一な組み換えが現時点では難しいために今後さらなる改良を必要であった。2)マススペクトロメトリーを用いた細胞内シグナルの総合的解析システムの確立情報伝達に関わる蛋白の機能的変化は数秒から数分間といった極めて短い時間で完遂し、次々に細胞内シグナルとして伝えられる。このようなシグナルを動的に捉えることを目的として、Surface Enhanced Laser Disorption(SELDI)TOF-MS法を用いて蛋白のリン酸化状態について定量的解析法の確立を行った。一般にリン酸化ペプチドは非リン酸化状態に比べ、イオン化しにくいことから合成リン酸化ペプチドを対照として用いて量の補正を行ったところ定量的な測定が可能であった。そこでこの系を用いて、具体的には培養細胞を材料として用い、p53分子について解析を行っている。