抗体固定化担体としての自己分散-凝集制御型ナノスフェアの開発

作为抗体固定化载体的自分散控制聚集纳米球的开发

• 批准号: 11167222
• 负责人: 竹山 春子
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11167222/
• 关键词: ナノスフェア; 磁気微粒子; アンカータンパク質; 抗体固定化担体; リポソーム; 有機薄膜

生体高分子の固定化担体としてのナノスフェアは、表面積、自由度における優位性から測定の高感度化、反応時間の短縮を達成するために効果的に利用される。しかしながら物性評価が困難であり、ハンドリングが煩雑であることから、その利用性は極めて制限を受ける。特に、磁気的に容易に運動制御できる磁性粒子を利用する場合、分散性を保持し、かつ高い凝集能を保つことは困難である。そこで、磁性粒子表面にpH、イオン強度により荷電を制御できる有機薄膜を融合することによって、自己分散-凝集制御が可能な磁性粒子の開発を目的とした。磁性細菌粒子は粒径50〜100mm、単磁区構造を有するマグネタイトより成る磁気微粒子である。またその表面は、ホスファチジルエタノールアミンを主成分とする脂質二重膜で覆われている。この磁性細菌粒子をモデル粒子として、分散性、抗体固定化条件について検討を行った。この性質を利用し、抗体を固定化した磁性細菌粒子の作製とイムノアッセイの高感度化に関する研究が行われている。その結果、粒子分散性は4〜7のpH変化に伴うアミノ基の極性に依存し、pH7において磁性細菌粒子の表面が負電荷を帯び、分散性が保持されることが示唆された。次に、人工的に有機薄膜を導入した磁気微粒子をDNA・抗体の固定化担体としたときの分散性や検出感度について検討を行った。DNAの担体として用いる場合、表面がマイナスにチャージしているため静電的吸着量は少量である。そこで、脂質2重膜を取り除いた磁性細菌粒子上に、1〜3つのアミノ基を有するシランカップリング剤を用いて被覆することにより表面の改質を行い、DNAの吸着量について比較した。その結果、コーティングしたシランカップリング剤のアミノ基の数が多くなるにつれDNAの吸着量の増加が確認された。さらに、同様のシランカップリング剤を用いて表面を改質した人工磁気微粒子と比較した結果、磁性細菌粒子を用いた場合、DNAの吸着量が約2倍多いことが示された。また、DNAが結合した磁気微粒子を磁気回収後に、等容量の2M NaClに懸濁したときに溶出されるDNA量について評価した結果、人工の磁気微粒子と比較して、磁性細菌粒子を用いたときには、顕著な溶出がおきていることが認められた。さらに、シランカップリング剤であるγ-aminopropyltriethoxysilane(γ-APTES)を用いて人工磁気微粒子の表面改質を行った。表面改質を行った場合、何も改質を行わない場合と比較し、凝集が起こりにくいことが示された。さらに、この粒子にgltaraldehyde(GA)、bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3)を用いて架橋したところ、分散性は安定に保たれていることが示された。このような抗体固定化磁気微粒子を用いて、環境ホルモンとして問題視されているビスフェノールAの検出を行ったところ、磁性細菌粒子と比較し検出限界は劣るものの感度の面で優れていることが示された。

Immobilization of biological polymer supports can be achieved through high sensitivity measurement, shortening of reaction time, and optimization of surface area and degree of freedom. The property evaluation is difficult, and the utilization is limited. Especially, it is easy to control the movement of magnetic particles, and it is difficult to maintain the dispersibility and high aggregation energy. The pH and strength of the magnetic particle surface, the charge control, the fusion of organic thin films, the self-dispersion-aggregation control, and the development of magnetic particles Magnetic bacteria particles have a particle size of 50~100 mm and a magnetic domain structure. The main component of the lipid double membrane is the lipid double membrane. The magnetic bacterial particles are dispersed, and the immobilization conditions are discussed. The study on the preparation of magnetic bacterial particles with high sensitivity by using antibody As a result, particle dispersibility changes from pH 4 to 7 with polarity dependence of the base, pH 7 with negative charge on the surface of magnetic bacterial particles, and dispersibility is maintained. Second, artificial organic thin film introduction of magnetic particles DNA antibody immobilization support and dispersion detection of sensitivity DNA support is used in small amounts on the surface. In addition, the lipid 2 heavy film can be removed from the magnetic bacterial particles, and the DNA adsorption amount can be compared with the surface modification of the magnetic bacterial particles. As a result, the increase in DNA uptake was confirmed by the increase in the number of active groups in the group. In addition, the amount of DNA adsorbed on the surface of artificial magnetic particles was about 2 times higher than that of magnetic bacteria particles. DNA binding to magnetic particles after magnetic recovery, equal volume of 2 M NaCl suspension, dissolution, DNA content evaluation results, artificial magnetic particles comparison, magnetic bacteria particles use, dissolution, identification, identification, In addition, the chemical agent Shilankakaplin is used to modify the surface of artificial magnetic particles using γ-aminopropyltriethoxysilane (γ-APTES). Surface modification is the most important aspect of the process. In addition, the particles of gltaraldehyde (GA), bis (sulfoximidyl) succinate (BS3) are used to bridge and disperse the particles. The antibody immobilized magnetic particles were used in the experiment, and the environmental conditions were observed. The magnetic particles were detected in the experiment, and the sensitivity was observed in the experiment.

项目成果

Y. Okamura: "Two-dimensional analysis of proteins specific to the bacterial particle membrane from Magnetospirillum sp.AMB-1"Appl. Biochem. Biotechnol.. (in press).

Y. Okamura：“对 Magnetospirillum sp.AMB-1 细菌颗粒膜特异性蛋白质的二维分析”Appl。

H.Takeyama: "Discrimination between Atlantic and Pacific Subspecies of the Northern Tuna(Thunnus thynnus) by Magnetic-Capture Hybridization Using Bacterial Magnetic Particles."Mar.Biotechnol.. 2. 309-313 (2000)

H.Takeyama：“通过使用细菌磁性粒子的磁捕获杂交来区分北金枪鱼（Thunnus thynnus）的大西洋和太平洋亚种。”Mar.Biotechnol.. 2. 309-313 (2000)

Y. Okamura: "Two-dimensional analysis of proteins specific to the bacterial particle membrane from Magnetospirillum sp.AMB 1. "Appl.Biochem.Biotechnol.. 84-86. 441-446 (2000)

Y. Okamura：“对 Magnetospirillum sp.AMB 1 细菌颗粒膜特异性蛋白质的二维分析。”Appl.Biochem.Biotechnol.. 84-86。

H. Takeyama: "Discrimination between Atlantic and Pacific Subspecies of the Northern Tuna (Thunnus thynnus) by Magnetic-Capture Hybridization Using Bacterial Magnetic Particles"Mar. Biotechnol.. (in press).

H. Takeyama：“通过使用细菌磁性粒子的磁捕获杂交来区分北方金枪鱼（Thunnus thynnus）的大西洋和太平洋亚种”Mar。

T. Matsunaga: "Construction of an automated DNA detection system for manipulation of Microcystis spp. using specific DNA probe immobilized on the magnetic particles."Electrochim.Acta.. 44. 3779-3784 (1999)

T. Matsunaga：“使用固定在磁性颗粒上的特定 DNA 探针构建用于操作微囊藻属的自动 DNA 检测系统。”Electrochim.Acta.. 44. 3779-3784 (1999)