直接PCR法による窒素固定藍藻の迅速かつ簡便な検出と評価

直接PCR法快速简便地检测和评价固氮蓝绿藻

• 批准号: 07750877
• 负责人: 竹山 春子
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07750877/
• 关键词: 窒素固定藍藻; 直接PCR; スクリーニング; nifH遺伝子

海洋には数多くの微細藻類が存在し、その中からの有用物質生産株のスクリーニングが盛んに行われている。本研究では、特にその中でも窒素固定能を有する海洋藍藻の迅速な検出を行うことにより効率的なスクリーニングを検討した。藍藻の窒素固定はニトロゲナーゼにより行われるが、条件によっては水素を発生することも可能である。本研究の特徴としては、サンプル中に存在するターゲット藻体を直接PCR法を用いて遺伝子レベルでキャラクタライズすることによって検出する点である。ニトロゲナーゼのサブユニットである鉄タンパクをコードするnifH遺伝子を検出のマ-カとし、相補性の高いところでプライマーをデザインした。次に窒素固定藍藻を用いて、DNAを抽出することなく細胞への直接PCRを行う際の最適条件の検討を行った結果、抽出DNAを用いるときよりは低いannealing温度55°Cで良好なnifH遺伝子の増幅が確認された。また、用いる細胞数も数個単位で検出可能であることが示された。モデル実験で得られた最適条件を利用し、実海水を用いて海洋窒素固定藍藻のスクリーニングを行った。多くのサンプル中、直接PCR法でnifH遺伝子の増幅が確認されたものにおいて数種の糸状性窒素固定海洋藍藻が分離された。それらの水素生成能を調べたところ、0.49μmolH_2/mg dry wt/hと高い生成速度が示された。また、温泉源付近より得たサンプル中からも同様な方法により窒素固定藍藻が分離された。このようにサンプル中に存在する微生物を遺伝子レベルで迅速に評価することにより、多くのサンプルを一次スクリーニングにかけることが可能になり、今までにかかっていた分離操作をより簡便にかつ迅速確実に行うことが可能になった。本法はターゲット遺伝子のシークエンスさえ明らかであれば、どのような微生物にも用いることが可能であると考えられる。

海洋中有许多微藻物种，并积极地筛选有用的产生物质菌株。在这项研究中，我们通过迅速检测出具有氮固定能力的海洋蓝细菌来研究有效的筛查。蓝细菌的氮固定是通过氮酶进行的，但在某些条件下也可以产生氢。这项研究的一个特征是，通过使用PCR在遗传水平上直接表征样品中存在的靶藻。编码铁蛋白的NIFH基因是氮气的亚基，用作检测标记，并在高度互补的位置设计了底漆。接下来，我们研究了直接在细胞上进行PCR的最佳条件，而无需使用氮固定的蓝细菌提取DNA，并在55°C的退火温度下与使用提取的DNA相比，在55°C的退火温度下发现了NIFH基因的良好扩增。还已经表明，可以以几个单位检测到所使用的单元的数量。使用模型实验中获得的最佳条件，我们使用实际的海水筛选了海洋氮固定的蓝细菌。从许多样品中分离出几种丝状氮固定海洋蓝细菌，在这些样品中，NIFH基因的扩增通过直接PCR证实。研究其氢生产能力时，发现其高生产率为0.49μmolh_2/mg干wt/h。此外，通过相同的方法，将氮固定的蓝细菌与从温泉源附近获得的样品分离。通过以这种方式快速评估样品中存在的微生物，许多样品可以进行初级筛查，从而可以更方便，快速，可靠地执行先前所需的分离操作。据认为，只要明确靶基因的序列，就可以在任何微生物中使用该方法。

项目成果

H.Takeyama,et al.: "Application of Bacterial Magnetic Particles as Novel DNA Carriers for Ballistic Transformation of a Marine Cyanobacterium." Biotechnology Techniques. 9. 355-360 (1995)

H.Takeyama 等人：“细菌磁性粒子作为新型 DNA 载体在海洋蓝细菌弹道转化中的应用”。

T.Matsunaga and H.Takeyama: "Genetic Engineering in Marine Cyanobacteria." J.Appl.Phycol.7. 77-84 (1995)

T.Matsunaga 和 H.Takeyama：“海洋蓝细菌的基因工程”。

Y.Wachi,H.Takeyama,et al.: "Screening of Melanin Biosynthesis Inhibitors from Marine Microalgae Using Streptomyces bikiniensis Bioassay." Biotechnology Techniques. 9. 633-6336 (1995)

Y.Wachi、H.Takeyama 等人：“使用比基尼链霉菌生物测定法从海洋微藻中筛选黑色素生物合成抑制剂”。

T.Matsunaga,H.Takeyama,et al.: "Screening of Marine Cyanobacteria for High Palmitoleic Acid Productivity." FEMS Microbiol.Lett.133. 137-141 (1995)

T.Matsunaga、H.Takeyama 等人：“筛选海洋蓝藻以提高棕榈油酸生产率”。

H.Takayama,et al.: "β-carotene production in a Novel Hydrogen-producing Marine Photosynthetic Bacterium Rhodovulum sulfidophilum by Cloning the Erythrobacterr longus Och101 crtI and crtY Genes." J.Mar.Biotechnol.(in press).

H. Takayama 等人：“通过克隆长红杆菌 Och101 crtI 和 crtY 基因，在新型产氢海洋光合细菌 Rhodovulum sulfidophilum 中生产 β-胡萝卜素。”（J.Mar.Biotechnol）。