直接PCR法による窒素固定藍藻の迅速かつ簡便な検出と評価

直接PCR法快速简便地检测和评价固氮蓝绿藻

• 批准号: 07750877
• 负责人: 竹山 春子
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07750877/
• 关键词: 窒素固定藍藻; 直接PCR; スクリーニング; nifH遺伝子

海洋には数多くの微細藻類が存在し、その中からの有用物質生産株のスクリーニングが盛んに行われている。本研究では、特にその中でも窒素固定能を有する海洋藍藻の迅速な検出を行うことにより効率的なスクリーニングを検討した。藍藻の窒素固定はニトロゲナーゼにより行われるが、条件によっては水素を発生することも可能である。本研究の特徴としては、サンプル中に存在するターゲット藻体を直接PCR法を用いて遺伝子レベルでキャラクタライズすることによって検出する点である。ニトロゲナーゼのサブユニットである鉄タンパクをコードするnifH遺伝子を検出のマ-カとし、相補性の高いところでプライマーをデザインした。次に窒素固定藍藻を用いて、DNAを抽出することなく細胞への直接PCRを行う際の最適条件の検討を行った結果、抽出DNAを用いるときよりは低いannealing温度55°Cで良好なnifH遺伝子の増幅が確認された。また、用いる細胞数も数個単位で検出可能であることが示された。モデル実験で得られた最適条件を利用し、実海水を用いて海洋窒素固定藍藻のスクリーニングを行った。多くのサンプル中、直接PCR法でnifH遺伝子の増幅が確認されたものにおいて数種の糸状性窒素固定海洋藍藻が分離された。それらの水素生成能を調べたところ、0.49μmolH_2/mg dry wt/hと高い生成速度が示された。また、温泉源付近より得たサンプル中からも同様な方法により窒素固定藍藻が分離された。このようにサンプル中に存在する微生物を遺伝子レベルで迅速に評価することにより、多くのサンプルを一次スクリーニングにかけることが可能になり、今までにかかっていた分離操作をより簡便にかつ迅速確実に行うことが可能になった。本法はターゲット遺伝子のシークエンスさえ明らかであれば、どのような微生物にも用いることが可能であると考えられる。

Marine に は more く の が し, micro algae そ の in か ら の useful material production plant の ス ク リ ー ニ ン グ が sheng ん に line わ れ て い る. In this study で は, に そ の で も smothering element fixed can have す を る Marine algae の quickly な 検 を row う こ と に よ り sharper rate な ス ク リ ー ニ ン グ を beg し 検 た. Cyanobacteria 's formaldehyde is fixed to <s:1> ニトロゲナ ニトロゲナ ゼによ ゼによ <s:1> われるが, and the conditions for the occurrence of によって <s:1> water in を are する, する と, <e:1> and である. This study の, 徴 と し て は, サ ン プ ル に exist す る タ ー ゲ ッ ト algae body を direct PCR method を with い て heritage 伝 son レ ベ ル で キ ャ ラ ク タ ラ イ ズ す る こ と に よ っ て 検 out す る point で あ る. ニ ト ロ ゲ ナ ー ゼ の サ ブ ユ ニ ッ ト で あ る iron objects タ ン パ ク を コ ー ド す る nifH posthumous son 伝 を 検 out の マ - カ と し, high fill phase sex の い と こ ろ で プ ラ イ マ ー を デ ザ イ ン し た. Time に smothering element fixed cyanobacteria を with い pump, DNA を て す る こ と な く cells へ の line direct PCR を う interstate の optimal condition の 検 line for を っ た results, take DNA を い る と き よ り は い low annealing temperature 55 ° C で good な nifH heritage 伝 son の raised が picture confirm さ れ た. Youdaoplaceholder0, using the number of 単 in the また る cells, で検 can figure out what might be である とが とが とが to された. モ デ ル be 験 で have ら れ た を use し optimum conditions, be seawater を い て Marine smothering element fixed cyanobacteria の ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. More く の サ ン プ ル で, direct PCR method in nifH heritage 伝 son の raised が picture confirm さ れ た も の に お い て several の si sex smothering element fixed Marine algae が isolated さ れ た. そ れ ら の water element can generate を adjustable べ た と こ ろ, 0.49 mu molH_2 / mg dry wt/h と い generate high speed が shown さ れ た. ま た, WenQuanYuan paying nearly よ り have た サ ン プ ル in か ら も with others な method に よ り smothering element fixed cyanobacteria が separation さ れ た. こ の よ う に サ ン プ ル に exist す る microbial を heritage 伝 son レ ベ ル で に quickly review 価 す る こ と に よ り, multiple く の サ ン プ ル を a ス ク リ ー ニ ン グ に か け る こ と が may に な り, today ま で に か か っ て い た separation operation を よ り simple に か つ quickly be truly に line う こ と が may に な っ た. This law は タ ー ゲ ッ ト heritage 伝 son の シ ー ク エ ン ス さ え Ming ら か で あ れ ば, ど の よ う な microbial に も with い る こ と が may で あ る と exam え ら れ る.

项目成果

H.Takeyama,et al.: "Application of Bacterial Magnetic Particles as Novel DNA Carriers for Ballistic Transformation of a Marine Cyanobacterium." Biotechnology Techniques. 9. 355-360 (1995)

H.Takeyama 等人：“细菌磁性粒子作为新型 DNA 载体在海洋蓝细菌弹道转化中的应用”。

Y.Wachi,H.Takeyama,et al.: "Screening of Melanin Biosynthesis Inhibitors from Marine Microalgae Using Streptomyces bikiniensis Bioassay." Biotechnology Techniques. 9. 633-6336 (1995)

Y.Wachi、H.Takeyama 等人：“使用比基尼链霉菌生物测定法从海洋微藻中筛选黑色素生物合成抑制剂”。

T.Matsunaga and H.Takeyama: "Genetic Engineering in Marine Cyanobacteria." J.Appl.Phycol.7. 77-84 (1995)

T.Matsunaga 和 H.Takeyama：“海洋蓝细菌的基因工程”。

H.Takayama,et al.: "β-carotene production in a Novel Hydrogen-producing Marine Photosynthetic Bacterium Rhodovulum sulfidophilum by Cloning the Erythrobacterr longus Och101 crtI and crtY Genes." J.Mar.Biotechnol.(in press).

H. Takayama 等人：“通过克隆长红杆菌 Och101 crtI 和 crtY 基因，在新型产氢海洋光合细菌 Rhodovulum sulfidophilum 中生产 β-胡萝卜素。”（J.Mar.Biotechnol）。

H.Takeyama,et al.: "DHA Enrichment of Rotifers;A Simple Two-step Culture Using the Unicellular Algae Chlorella regularis and Isochrysis galbana." J.Mar.Biotechnol.(in press).

H.Takeyama 等人：“轮虫的 DHA 富集；利用单细胞藻类小球藻和等鞭金藻的简单两步培养”。