グルタチオン合成代謝系酵素の立体構造と機能

谷胱甘肽合成代谢酶的三维结构与功能

• 批准号: 11169232
• 负责人: 小田 順一
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Fukui Prefectural University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11169232/
• 关键词: グルタチオン; フィードバック阻害; γ-グルタミルシステイン合成酵素; グルタミン酸脱水素酵素; 多波長異常分散法; グルタチオン合成酵素

本研究では、グルタチオンの合成を制御するキーとなる大腸菌由来γ-グルタミルシステイン合成酵素(GCS)およびグルタミン酸脱水素酵素(GLDH)について、X線結晶構造解析によって構造を明らかにし、酵素レベルでのフィードバック制御やアロステリックな調節に基づいたグルタチオン合成代謝系制御の分子機構の解明を目指した。GCSについては、真核生物由来の酵素の場合と同様になんらかの活性調節因子が酵素分子表面にあるシステイン残基と反応し、それによってグルタチオンによるフィードバック阻害が制御されている可能性について検討するため、表面システイン残基をセリンに系統的に置換した変異体を作成し、その酵素化学的・生化学的性質について検討を行った。その結果、グルタチオンによるフィードバック阻害制御には直接関与しないこと、従って異なるフィードバック阻害機構が存在することが示唆された。一方、既にnative GCSの結晶化には成功しており、さらに位相決定のための重原子誘導体結晶の作成を行った。Methionine pathway inhibition methodを用いてSeMet変異体を作成し、シッティングドロップ法によるその結晶化に成功した。そこで、Spring8のビームラインBL41XUにおいてMAD解析を行うための回折データの収集を行った。得られた回折データについては現在解析中である。GLDHに関しては、ハンギングドロップ法を用いて結晶化条件の検討を行った。結晶化剤として硫酸アンモニウムを用いてglutamate-NADH-GLDH複合体結晶が、PEGメチルエーテル5000を用いて2-oxoglutarate-NADH-GLDH複合体結晶が得られた。特に後者の複合体に関してはこれまでに結晶化が報告された例はなく、本酵素の構造変化と機能の関係について新たな知見が得られるものと期待される。

This study で は, グ ル タ チ オ ン の synthetic を suppression す る キ ー と な る coliform origin gamma グ ル タ ミ ル シ ス テ イ ン synthetase (GCS) お よ び グ ル タ ミ ン acid dehydration vegetable enzyme (GLDH) に つ い て, X-ray crystal structure analytic に よ っ て tectonic を Ming ら か に し, enzyme レ ベ ル で の フ ィ ー ド バ ッ ク suppression や ア ロ ス テ リ ッ The <s:1> な regulates the に base づ たグ たグ タチ タチ た <s:1> anabolic system controls the <s:1> molecular mechanism <e:1> explains the を target finger た. GCS に つ い て は eukaryotes origin の and enzyme と の occasions with others に な ん ら か の activity regulating factor が enzyme molecular surface に あ る シ ス テ イ ン residues と anti 応 し, そ れ に よ っ て グ ル タ チ オ ン に よ る フ ィ ー ド バ ッ ク resistance against が suppression さ れ て い る possibility に つ い て beg す 検 る た め, surface シ ス テ イ ン residues を セ リ ン に system The に substitution of the た variant を is made into the て検, そ, and the biochemical properties of the <s:1> enzyme chemistry に を て検 て検 て検 discuss を and った. そ の results, グ ル タ チ オ ン に よ る フ ィ ー ド バ ッ ク resistance against suppression に は masato directly with し な い こ と, 従 っ て different な る フ ィ ー ド バ ッ ク resistance against institutions が す る こ と が in stopping さ れ た. Side, both に native GCS の crystallization に は successful し て お り, さ ら に phase decision の た め の induced crystallization body の heavy atoms into line を っ た. The Methionine pathway inhibition methodを was prepared using the を てSeMet variant を, and the によるそ <s:1> グドロップ グドロップ グドロップ グドロップ method によるそ <s:1> crystallization に was successful た た. そ こ で, Spring8 の ビ ー ム ラ イ ン BL41XU に お い て MAD line analytical を う た め の inflexion デ ー タ の 収 row っ を た. We get られた and then fold it back to デ タに タに られた て て. Now in the analysis, である. GLDH に masato し て は, ハ ン ギ ン グ ド ロ ッ を プ method with い て crystallization conditions の 検 line for を っ た. Crystallization tonic と し て sulfate ア ン モ ニ ウ ム を with い て glutamate - NADH - GLDH complex crystal が, PEG メ チ ル エ ー テ ル 5000 を using い て 2 - oxoglutarate - NADH - GLDH complex crystal が must ら れ た. Special に latter の complex に masato し て は こ れ ま で に crystallization が report さ れ た example は な く, this enzyme の structure - function of と の masato is に つ い て new た な knowledge が must ら れ る も の と expect さ れ る.

项目成果

T.Hibi: "Structural analysis of γ-glutamylsystein synthetase from Escherichia coli B."Spring-8 User Experimental Report. 5. 258 (2000)

T.Hibi：“大肠杆菌 B 的 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的结构分析”Spring-8 用户实验报告。 5. 258 (2000)

N. Tokutaka: "The absolute configuration of an intermediate cyclic sulfoximine in the asymmetric synthesis of transition-sate analog inhibitors of γ-glutamylcysteine synthetase"Acta Crystallographica. C55. 1598-1599 (1999)

N. Tokutaka：“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶过渡态类似物抑制剂的不对称合成中的中间体环状亚磺酰亚胺的绝对构型”Acta Crystallographa 1598-1599（1999）。

N.Tokutake: "The absolute configuration of an intermediate cyclic sulfoximine in the asymmetric synthesis of transition-state analog inhibitors of γ-glutamylcysteine synthetase."Acta Crystallography. C55. 1598-1599 (1999)

N.Tokutake：“γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶过渡态类似物抑制剂的不对称合成中中间体环状亚磺酰亚胺的绝对构型。”晶体学报1598-1599（1999）。