植物における分化発現制御に関わるゲノムDNAメチル化部位の解析法の確立

点击翻译按钮获取中文摘要

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)存在下で脱分化的増殖をしている細胞,およびこの細胞を2,4-Dを含まない培地に移植してアントシアニン合成という代謝的分化を誘導した細胞からゲノムDNAを抽出し,これをメチル化感受性および非感受性の制限酵素を用いて切断した後,これらの制限酵素に対するアダプターをライゲーションし,放射性同位元素で標識したメチル化検出用-AFLP プライマーを組み合わせてPCR反応を行い,その反応物をシーケンス・ゲルによって分離し,バンドをX-線フィルムにて検出した。その結果,分化細胞特異的にメチル化が生じているDNA領域に対するバンドとして3本,脱分化細胞ではメチル化されているものが,分化に伴って脱メチル化されているバンドととして3本が得られた。それらをクローニングして塩基配列を決定したところ、96本中,22本が葉緑体およびミトコンドリアの遺伝子であり,残りが核内遺伝子であることがわかり,多くの核外遺伝子がメチル化されていることがわかった。また,これらの培養細胞から核DNAを抽出して,メチル化感受性制限酵素で切断した後,サザン・ブロット法により,ここで得られた核内遺伝子由来のDNA断片領域においてメチル化・脱メチル化が分化状態の違いによってどのように変化しているのか調べたところ,ここで調べた24本の中で4本において分化状態によってメチル化が変化していることが見い出されたが,その他については明瞭なメチル化の変化は見い出されたなかった。