多段階逐次反応を触媒する複合酵素系の設計

催化多步顺序反应的复杂酶系统的设计

• 批准号: 11876026
• 负责人: 上領 達之
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11876026/
• 关键词: 多酵素複合体; ステロール運搬蛋白質-2; ステロール運搬蛋白質-x; 胆汁酸; 線虫 C.elegans; ペルオキシソーム

細胞内が行なう多段階逐次反応を、精製酵素を用いて再現することは容易でない。胆汁酸合成における側鎖切断(II型β酸化系による)もその例である。我々はこの反応の第2段目以降を試験管内で再現することに成功した。成功の理由は、酵素本体と融合しているが反応には直接関与しないドメイン(通称のSCP2は実態を反映しないので、CLPと仮称する)が除かれた線虫の酵素を利用した点にある。本研究は多酵素複合体の自由な設計に資するため、CLPに関する次の諸点を明らかにした。(1)CLPの2量体形成:CLPの働きに関する作業仮説は、このドメインの2量体形成を前提にしている。そこで酵母CLPの相互作用を表面プラズモン共鳴法、およびMALDI-TOF法とESI法による質量分析、ならびに超遠心分析法によって解析した。その結果、少なくともその一部が室温の水溶液条件下で2量体を形成していること、その解離常数は10^<-5>M以下であること、が明らかになった。(2)CLP部分の切断酵素活性の検出と精製:ラット肝ペルオキシソームの破砕液中に、II型チオラーゼのCLP部分を切断する活性を検出した。II型β酸化系の2頭酵素もCLPとの融合蛋白質であり、活性な画分では大部分CPLを欠いているが、ラットII型チオラーゼ(通称はSCPx)を用いたアフィニティー法で部分精製されたCLP切断酵素標品は、2頭酵素には作用しなかった。(3)線虫のII型チオラーゼの解析:II型β酸化系の試験管内構築の鍵となった線虫のII型チオラーゼが、腸組織のペルオキシソームに局在し、胚の脂肪が消費された後の幼生期に強く発現し、αメチル側鎖をもつ薬剤で誘導されることを明らかにした。これらの結果は、本酵素が間違いなくラットII型チオラーゼの対応物であることを示す。

It is easy to reproduce the multi-step sequence of enzymes in cells. Bile acid synthesis is blocked (type II beta acidification system). The second paragraph of the article was successfully reproduced in the tube. The reason for success is that the enzyme itself is directly related to the fusion process, and the enzyme is directly related to the fusion process (commonly known as SCP2 status reflection process, CLP process). This study focuses on the following aspects of the free design of multienzyme complexes: (1)CLP's 2-volume formation:CLP's operation related to CLP, CLP's operation related to CLP's 2-volume formation The interaction between yeast and CLP was analyzed by resonance, MALDI-TOF and ESI methods. As a result, a part of the solution is formed at room temperature and in aqueous solution, and the dissociation constant is less than 10^<-5>M. (2) Detection and purification of enzyme activity in CLP part: detection of enzyme activity in CLP part of type II and type III Type II β-acidifying enzyme CLP fusion protein is partially purified by the method of CPL cleavage enzyme, and the activity of CLP fusion protein is partially purified by the method of CPL cleavage enzyme. (3)Analysis of type II cytokinesis of the parasite: Type II beta acidification system is the key to the construction of the test tube of the parasite type II cytokinesis, intestinal tissue selection and development, embryonic fat consumption, and postnatal strong development, alpha cytokinesis, and induction of cytokinesis. The result is that the enzyme is not compatible with the enzyme.