Campylobacter rectusの熱ショックタンパク質の遺伝子解析

歯周病原性細菌の1つであるCampylobacter rectus菌体より熱ショックタンパク質に属するGroEL様タンパク質を抽出し、この分子の構造解析を試みた。ATP-agaroseカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーとSDS-PAGEを応用した電気溶出により得られた64kDaタンパク質のN末端アミノ酸配列はAKEIFFSDEARNRLYEGVRKLNDAVKVTMGPRGRNであり、SwissProt data bankを利用した相同性の探索によりHelicobacter pylori GroELと83%(29残基/35残基)と特に高い相同性を示すことが明らかとなった。そこで、このデータを利用したセンスプライマー及びH.pylori含め他の細菌由来GroELにおいても相同性の高いC末端側配列(-GGMGGMM)を利用してアンチセンスプライマーを設計し、C.rectus由来genomic DNAをテンプレートとしたPCRを行った。PCR産物はアガロース電気泳動にて純度を確認後、digoxigenin標識してプローブとした。C.rectus genomic DNAを制限酵素で切断後、サンプルを電気泳動、膜転写して前述のプローブによるサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Hind IIIは1450と948bp、Pst Iは2950bp、Bam HIは6400bpの部位で反応バンドが認められた。今後、Pst I処理サンプルの反応バンド付近のDNA断片を抽出し、ベクターに組み込んだ後、大腸菌へ形質転換させて、C.rectus GroEL様タンパク質の遺伝子解析を進めていく予定である。

歯周病原性細菌の1つであるCampylobacter rectus菌体より熱ショックタンパク質に属するGroEL様タンパク質を抽出し、この分子の構造解析を試みた。ATP-agaroseカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーとSDS-PAGEを応用した電気溶出により得られた64kDaタンパク質のN末端アミノ酸配列はAKEIFFSDEARNRLYEGVRKLNDAVKVTMGPRGRNであり、SwissProt data bankを利用した相同性の探索によりHelicobacter pylori GroELと83%(29残基/35残基)と特に高い相同性を示すことが明らかとなった。そこで、このデータを利用したセンスプライマー及びH.pylori含め他の細菌由来GroELにおいても相同性の高いC末端側配列(-GGMGGMM)を利用してアンチセンスプライマーを設計し、C.rectus由来genomic DNAをテンプレートとしたPCRを行った。PCR産物はアガロース電気泳動にて純度を確認後、digoxigenin標識してプローブとした。C.rectus genomic DNAを制限酵素で切断後、サンプルを電気泳動、膜転写して前述のプローブによるサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Hind IIIは1450と948bp、Pst Iは2950bp、Bam HIは6400bpの部位で反応バンドが認められた。今後、Pst I処理サンプルの反応バンド付近のDNA断片を抽出し、ベクターに組み込んだ後、大腸菌へ形質転換させて、C.rectus GroEL様タンパク質の遺伝子解析を進めていく予定である。