蛋白質分子間相互作用の直接測定

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本研究は、蛋白質分子を二次元面上に配向させて並べ、その相互作用を表面力直接測定より評価し、蛋白質分子間の特異的、非特異的相互作用を分子レベルで研究する新しい方法論を提出することを目的とする。具体的には、コロイドプローブ原子間力顕微鏡を中心手段とし、構造形成する蛋白質間、蛋白質と特異的の相互作用する分子間の相互作用を直接測定から評価した。相互作用の様式、制御因子を明らかにし、一般的に蛋白質間の相互作用を研究するための新しいアプローチを提出した。ポリヒスチジン(His-tag)で遺伝子工学的に蛋白質の特定の部位を修飾し大量発現させ、イミノジアセテート-Cu^<2+>を親水基とする単分子膜(DSIDA)の表面に結合させた。ポリヒスチジン基はイミノジアセテートCu^<2+>基に強く結合するため、蛋白質が二次元膜面上に配向した試料が得られる。この蛋白質結合単分子膜をガラス基板とコロイド粒子(カンチレバーの先端に固定)上に移しとり、その間の相互作用をコロイドプローブ原子間力顕微鏡で測定した。蛋白質としては、DNAの同一の部位に結合することが知られている(1)RNAポリメラーゼのSigmaAユニットと転写制御因子であるSpo0Aについて測定を行った。C端へのポリヒスチジンの導入においては、蛋白質の特性が保たれることが確認した。(2)ビオチン修飾によりDNAを表面に固定化しSpo0AとDNAの相互作用についても検討した。相互作用の特性を、表面力曲線や接着力のpH依存性から明らかにした。蛋白質の表面への結合は、水晶発振子で確認する。