細胞内における調節タンパク質機能解析のためのmRNA発現制御技術の検討

用于细胞内调节蛋白功能分析的mRNA表达控制技术的检验

• 批准号: 11878129
• 负责人: 石渡 信一
• 金额: --
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878129/
• 关键词: DNAチップ; ケージドDNA; 温度パルス顕微鏡法; DNAの光熱変性; 心筋細胞培養系; 共焦点顕微鏡; PCR法; ゲージドmRNA

Caged遺伝子の合成:Caged mRNAを作成するための第一段階として、Caged DNAの調製を試みた。すなわち、DNA塩基のアミノ基を化学修飾(Cage化)することによって複製機能を失活し、紫外光照射によってCageを外して再活性化させることのできる不活性化DNAを合成した。その結果、光照射によって複製機能がある程度再生可能であることを、PCR法を用いて確認した。細胞操作と共焦点顕微鏡観察:心筋細胞培養系での自動拍動現象におけるCaイオンの時空間パターン(Ca wave)を、Ca感受性蛍光色素を細胞内に導入することによってビデオレートで蛍光共焦点顕微観察・記録することができた。この細胞実験系は、Caged遺伝子を導入のために不可欠のものである。遺伝子の固定化と選択回収技術:DNA多成分同時分取法を確立する目的で、近赤外レーザー光を用いてチップ上の局所領域のみを加熱変性し、特定のDNA断片を回収することのできるDNAチップの基本実験を行った。6nmの厚さにクロム蒸着したガラス基板上にDNAプローブを固定し、蛍光ラベルした試料DNAプローブを流して蛍光観察したところ、試料DNAプローブが均質に付着していた。そこで、このクロム蒸着面に近赤外レーザー集束光を顕微鏡下で照射して局所加熱し、μmオーダーの空間分解能でDNAを熱変性したところ、局所分離することに成功した。解離したDNAはPCR増幅することができ、また残った固定DNAの方も、変性することなく可逆的に試料DNAを再結合した。また基板の蒸着クロムを面電極としてDNAを基板表面に誘導することができた。さらに、試料DNAが特定の領域としか結合しないこと、特定の領域のDNAのみを回収できることを確認した。以上3つの技術を実現したことによって、本研究課題を推進するための第一歩を踏み出すことができたと考える。

Caged spool synthesis: Caged mRNA is used to make the first paragraph of the test, and the Caged DNA attempt is made. In this paper, the chemical modification (cageization) of the basic chemical reaction (DNA), the inactivation of the replicator, the irradiation of ultraviolet light, the reactivation of the Cage, the inactivation of DNA and the synthesis of DNA were studied. The results of the test, the degree of regeneration of the replication mechanism after light irradiation and the possibility that the PCR method was used to confirm the accuracy. Cell manipulation confocal microscopical observation: the cardioplegic cell culture system includes the autobeat, Ca, time and space analyzer (Ca wave), and Ca sensitive photosensitive photoluminescence (Ca) photoluminescence. You can't owe your debt to your family if you don't want to know. Select the return technology: DNA multi-component simultaneous extraction method to ensure the purpose of the target, near-infrared light is used in the field of the station to increase the accuracy, specific DNA fragments to determine the accuracy of the DNA system. The 6nm is thickly steamed, the DNA is fixed, the light is DNA, the flow is light, the light is low, and the DNA is fine. On the surface of the noodles, the micrometer is used to irradiate the local light source, and the space decomposition of the optical fiber and the micrometer can be used to analyze the DNA property of the product. Detach the DNA PCR, fix the DNA, and recombine the DNA with the reversible DNA. The surface of the substrate is steamed, and the surface of the DNA substrate is used to guide the temperature response. The specific domain information is combined with the specific domain DNA information, and the specific domain DNA information is returned to the customer for confirmation. The above three technical programs have been successfully completed, and this research project has been promoted. The first step is to take an examination of the first step of the project.

项目成果

Okano K,et al.: "Position-specific release of DNA from A chip by using photothermal denaturation."Sensors and Actuators. (in press). (2000)

Okano K 等人：“通过使用光热变性从 A 芯片中特定位置释放 DNA。”传感器和执行器。

Yasuda K,et al.: "Focal extraction of surface-bound DNAs from a microchip using photo-thermal denaturation."Biotechniques. (in press). (2000)

Yasuda K 等人：“利用光热变性从微芯片中聚焦提取表面结合的 DNA。”生物技术。

Kato,H.et al.: "Imaging of thermal activation of actomyosin motors."Proc.Nath.Acad.Sci.USA. 96. 9602-9606 (1999)

Kato,H.等人：“肌动球蛋白马达热激活的成像。”Proc.Nath.Acad.Sci.USA。