細胞機能の発現を制御し解析するための遺伝子操作技術の開発

开发基因操作技术来控制和分析细胞功能的表达

• 批准号: 12878126
• 负责人: 石渡 信一
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12878126/
• 关键词: DNAチップ; ケージドDNA; ケージド遺伝子; PCR法; 心筋細胞培養系; GFP-アクチン; アクチンフィラメント; ストレスセンサー

Caged遺伝子の合成:Caged mRNAを作成するために、Caged DNAの調製を試みてきた。Cagedのための一つの方策として、DNA塩基のアミノ基をDMNBB(4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl bromide)で化学修飾し、DNAの複製機能を一旦失活させ、それを紫外線照射によって再活性化する、という方針で不活性化DNAの合成を試みた。一時はPCR法によって確認できたと思われたが、再現性に問題があり、結局DNA塩基のアミノが化学修飾に対して活性が高くない、という結論に達した。この間、Caged遺伝子を調製したという報告が数編発表される状況になったので、我々は方針を転換し、目的の研究課題の鍵となる、新しいタイプのDNAチップや細胞操作開発、それに、細胞機能解析のための新手法の開発に力を入れることとした。遺伝子の固定化と選択的回収技術:昨年度までの研究を進め、Cr基盤上へのDNA固定化法と、赤外レーザー照射による選択的な回収法を確立し、その方法の詳細を論文として公表した。GFP-アクチンの心筋培養細胞内発現:ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12へ、蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを導入すること、そしてその未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。その過程でGFP-アクチンがどのように細胞骨格や筋原線維収縮系に組み込まれていくかを、共焦点蛍光顕微鏡を用いて解析している。アクチンフィラメントをストレスセンサーとして用いることの試み:GFP-アクチンを用いて、アクチンフィラメントに加わる張力を蛍光画像化するための方法を開発しようと、幾つかの試みをした。アクチンフィラメントをストレスセンサーとして用いることが出来れば、その細胞機能解析への応用は計り知れないものがある。

Synthesis of 伝 offspring of Caged :Caged mRNAを is made into するために, and Caged DNA <s:1> is modulated を test みて た た た. A Caged の た め の つ の order と し て, DNA salt base の ア ミ ノ base を DMNBB (4, 5 - dimethoxy - 2 - nitrobenzyl Bromide) で chemically modified の し, DNA replication function を once the deactivation さ せ, そ れ を ultraviolet irradiation に よ っ て again activeness す る, と い う policy で try not activeness の DNA synthesis を み た. A は PCR method に よ っ て confirm で き た と think わ れ た が, reproducibility に が あ り, ending DNA salt base の ア ミ ノ が chemically modified に し seaborne て high active が く な い, と い う conclusion に da し た. こ の, Caged but 伝 を modulation between し た と い が う report compiling 発 table さ れ る condition に な っ た の で, I 々 は policy を planning research topics in し, purpose の の key と な る, new し い タ イ プ の DNA チ ッ プ や cell open 発 operation, そ れ に, cell function analytical の た め の の twist to open 発 を に force into the れ る こ と と し た. Posthumous son 伝 の immobilized と sentaku back 収 technology: yesterday's annual ま で を の research into め, Cr base plate へ の と DNA immobilized method, red レ ー ザ ー irradiation に よ る sentaku な back 収 を established し, そ の way の detailed を paper と し て male table し た. GFP - ア ク チ ン の 発 now: heart muscle training cell ニ ワ ト リ の undifferentiated tendons, bud cells マ ウ ス reinforcement bud cell line C2C12 へ 蛍 light タ ン パ ク qualitative GFP を fusion し た ア ク チ ン の プ ラ ス ミ ド を import す る こ と, そ し て そ の undifferentiated cells を steel tube へ と differentiation さ せ る こ と を try み た. そ の process で GFP - ア ク チ ン が ど の よ う に cells bone や muscle line d 収 shrinkage is に group み 込 ま れ て い く か を, total focus light 蛍 顕 micromirror を with い て parsing し て い る. ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を ス ト レ ス セ ン サ ー と し て in い る こ と の try み : GFP - ア ク チ ン を with い て, ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト に plus わ る tension を 蛍 light portraits the す る た め の way を open 発 し よ う と, several つ か の try み を し た. ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を ス ト レ ス セ ン サ ー と し て in い る こ と が out れ ば, そ の cell function analytical へ の 応 in は り know れ な い も の が あ る.

项目成果

Yasuda,K. et al.: "Focal extraction of surface-bormd DNA from a microchip using photo-thermal denaturation."Biotechnigues. 28. 1006-1011 (2000)

安田，K.

Nishizaka,T. et al.: "Characterization of single actomyosin rigor bonds.-hoad-dependence of lifetime and mechanical properties-"Biophys.J.. 79. 962-974 (2000)

西坂，T.

岡野和宣 ら: "DNAプローブアレイを用いたDNA断片回収"電気学会誌(センサーマイクロマシン部内誌). 4月号(印刷中). (2001)

Kazunobu Okano 等人：“使用 DNA 探针阵列恢复 DNA 片段”日本电气工程师学会期刊（传感器微机械部门内部杂志）4 月号（目前正在印刷）。

Kawaguchi,K.and Ishiwata,S.: "Nucleoside-dependent single-to double-headed binding of kinesin"Science. 291. 667-669 (2001)

Kawaguchi,K. 和 Ishiwata,S.：“驱动蛋白的核苷依赖性单头到双头结合”科学。

Kawaguchi,K.& Ishiwata,S.: "Temperature dependence of force, velocity and processivity of single kinesin melecules."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 272. 895-899 (2000)

川口，K.