マウスを用いた新規視物質遺伝子の導入による色覚高次化機構の解明

マウスは2種類の錐体視物質を同一の錐体細胞で発現していることが明らかとなり、新規視物質遺伝子の導入による色覚高次化機構の解明には適さないことが明らかになった。そこで対象をゼブラフィッシュのみに絞ることとした。ゼブラフィッシュの桿体視物質遺伝子についてgreen fluorescent protein(GFP)レポーター遺伝子を用いてプロモーター解析をおこなった。桿体視物質遺伝子については隣接上流DNA領域4.2、2.5、1kbを用いてGFP発現誘導能を調べた。各発現コンストラクトをゼブラフィッシュの受精卵にマイクロインジェクションし、それぞれ50%以上の個体で網膜にGFPの発現を確認した。さらに10-30%の個体では脳、おそらく松果体にGFP発現を観察した。4.2kbの上流域コンストラクトを導入した個体約100匹のうち1匹は次世代に発現コンストラクトを伝達した。このことはF1でのゲノムDNAに対するPCR及びサザンハイブリダイゼーションにより実証した。その個体をfounderとしてF1及びF2を飼育し、GFPの発現が眼球特異的であることをウェスタンブロッティング及びGFP発光観察により確認し、さらに網膜の桿体視細胞特異的であることをGFP発光観察により立証した。さらにGFP発現誘導開始時期は桿体視物質遺伝子発現と同じ受精後48時間であり、開始場所は網膜腹側の同一箇所であることも確認した。これらから桿体視物質遺伝子のプロモーター領域が遺伝子上流4.2kb内にあることが明らかとなった。インジェクションをおこなった個体にみられた松果体での発現誘導はトランスジェニックラインでは観察されなかった。

マウスは2種類の錐体視物質を同一の錐体細胞で発現していることが明らかとなり、新規視物質遺伝子の導入による色覚高次化機構の解明には適さないことが明らかになった。そこで対象をゼブラフィッシュのみに絞ることとした。ゼブラフィッシュの桿体視物質遺伝子についてgreen fluorescent protein(GFP)レポーター遺伝子を用いてプロモーター解析をおこなった。桿体視物質遺伝子については隣接上流DNA領域4.2、2.5、1kbを用いてGFP発現誘導能を調べた。各発現コンストラクトをゼブラフィッシュの受精卵にマイクロインジェクションし、それぞれ50%以上の個体で網膜にGFPの発現を確認した。さらに10-30%の個体では脳、おそらく松果体にGFP発現を観察した。4.2kbの上流域コンストラクトを導入した個体約100匹のうち1匹は次世代に発現コンストラクトを伝達した。このことはF1でのゲノムDNAに対するPCR及びサザンハイブリダイゼーションにより実証した。その個体をfounderとしてF1及びF2を飼育し、GFPの発現が眼球特異的であることをウェスタンブロッティング及びGFP発光観察により確認し、さらに網膜の桿体視細胞特異的であることをGFP発光観察により立証した。さらにGFP発現誘導開始時期は桿体視物質遺伝子発現と同じ受精後48時間であり、開始場所は網膜腹側の同一箇所であることも確認した。これらから桿体視物質遺伝子のプロモーター領域が遺伝子上流4.2kb内にあることが明らかとなった。インジェクションをおこなった個体にみられた松果体での発現誘導はトランスジェニックラインでは観察されなかった。