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霊長類色覚視物質の赤外分光研究

灵长类色觉物质的红外光谱研究

基本信息

批准号：
13J30007
负责人：
片山耕大
金额：
$ 1.77万
依托单位：
Nagoya Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013 至 2014
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では色覚視物質に対する赤外分光法を用いた世界で唯一の構造解析を受けて、X線結晶構造解析により原子座標を決めることで色を識別するメカニズムをより詳細に理解することが目的である。本年度の研究成果の概要を以下に記述する。霊長類(ヒト)の色覚を担う視物質は、試料調製が困難なことからX線結晶構造解析を含めた構造生物学的研究はこれまで皆無であった。そのような現状下、私は培養細胞により発現させた霊長類色覚視物質に対する赤外分光法を用いた構造解析を6年前に開始した。発現量の低さ、光退色や熱安定性、タンパク質の凝集など、数々の問題を克服することで、昨年末の青視物質のスペクトル測定の成功をもって、ついに赤・緑・青3色全ての色覚視物質のスペクトル解析を完了させることができた。そしていよいよ色覚視物質の原子座標を決めるという夢を実現するべく、今年の1月から米国のCase Western Reserve大学薬学部専攻長Palczewski博士の研究室に参入した。当研究室は分子基盤に基づいた視覚研究分野において世界をリードするラボであり、視覚研究に最適な研究環境が整っている。今回私は、これまでの経験からタンパク質の取り扱いが最も容易な霊長類(ヒト)緑感受性視物質の結晶化に向けた大量発現に取り掛かった。発現には昆虫細胞を用いた新たな発現システムを使用するなど、発現系の確立には困難をきわめたが、すでに培養溶液1Lあたりミリグラムオーダーのタンパク質の発現にも成功しており、結晶化という夢実現に向けて大きな一歩を踏み出すことができた。一方で、哺乳類細胞を用いた発現系と比較して、目的タンパク質の単離の際に不純物の混入による影響から純度が低い問題も生じてきており、タンパク質精製の最適化も今後行っていく予定である。色覚視物質も含めた膜タンパク質の結晶化は、親水性が小さいことや、不安定でゆらぎに富んだ構造を有することから結晶化には不向きとされている。そこで私は、親水性表面を拡張させる目的でモノクローナル抗体フラグメントとの複合体の結晶化にも取り組む。これには未変性のタンパク質の親水性表面の立体構造を特異的に認識して結合する抗体を産生する必要があるが、幸いタンパク質のゆらぎを最小限に抑えられる可能性がある抗体を産生することにも成功している。今後、色覚視物質との複合体検証実験を行うとともに、複合体の結晶化にも挑戦する予定である。最終的には、赤外分光解析から得た構造情報とX線結晶構造解析から得られる原子座標を組み合わせることで、色覚視物質の構造解析を完了させる。

This study aims to provide a detailed understanding of the structural analysis of the X-ray crystallographic structure, atomic coordinate determination, color identification, and the use of infrared spectroscopy for the determination of color matter. A summary of the research results of this year is described below. It is difficult to adjust the color of the long class depending on the material and the sample. It is difficult to analyze the X-ray crystal structure, including the study of structural biology. In the present situation, the development of cultured cells and the application of infrared spectroscopy to structural analysis began six years ago. The problems of low emission, light fading, thermal stability, aggregation and number of color substances have been overcome. At the end of last year, the successful determination of the color substances of green, green and green has been completed. In January of this year, Dr. Palczewski, Director of the Department of Biology at Case Western Reserve University in the United States, participated in the research of atomic coordinates of color and visual substances. When the laboratory is located in the molecular base, the visual research field is divided into two parts: the first part is located in the molecular base, and the second part is located in the visual research field. In this paper, it is the easiest to obtain the crystal of the green sensitive substance. The development of insect cells in the process of development is difficult to establish. The development of insect cells in the process of development is difficult to establish. On the one hand, the problems of low purity due to the influence of impurities mixed in when using mammalian cells and the separation of target substances arise, and the optimization of the purification of target substances will be determined in the future. The color of the material contains a thin film, a crystalline material, a hydrophilic material, a stable material, a rich structure, a crystalline material, and a hydrophilic material. For the purpose of crystallization of the complex, the hydrophilic surface of the complex is formed. The ability to generate antibodies is limited by the specific understanding of the three-dimensional structure of the hydrophilic surface of the polymer. In the future, the color of the material and the complex identification process, the crystallization process of the complex Finally, the structural information obtained by spectroscopic analysis and X-ray crystallographic analysis was analyzed. The atomic coordinates were combined. The structural analysis of chromatic substances was completed.