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ロドプシン-G蛋白質相互作用の分子機構の時系列に沿った実体解明

视紫质-G蛋白相互作用分子机制的时间序列阐明

基本信息

批准号：
00J03492
负责人：
森住威文
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度、本研究は生理的条件下におけるロドプシン・トランスデューシン(Gt)の蛋白質間相互作用機構の解明を主目的として進めた。まず、検出器に高性能CCDを用いた分光光度計を開発しロドプシン測定に適用することにより、ミリ秒の時間領域におけるロドプシンの吸光度変化を観測できるようになつた。光を吸収したロドプシンはミリ秒の時間領域で活性中間体、メタIIを生成しGtを活性化するため、この過程の研究に十分な時間分解能が得られたといえる。次に、より生理的な試料条件を実現するため、ウシ網膜の視細胞外節膜(ROS膜)をそのまま測定に用いることを試みた。しかしながら、濁りの多い試料は光を散乱してしまうため吸光度測定にとって致命的であり、ROS膜懸濁液をそのまま測定することは難しかった。そこで超音波破砕法を導入したところ、生理的条件を保ちつつ極めて濁度の低い試料を得ることができた。この試料と上記分光光度計により、世界で始めて生体内温度におけるメタII中間体とその前駆中間体との平衡を観測することに成功した。この試料に、同じくウシ網膜より精製した三量体GtとGTPの非加水分解型アナログであるGTPγSを添加して吸光度変化を測定したところ、従来、Gtを唯一結合しうると考えられてきたメタII中間体が生成する以前から、GtとロドプシンがGtの活性化を伴わない相互作用を行っていることが明らかになった。さらに、GtとGDPを添加した試料の測定により、この先駆相互作用はGDP結合型のGtによって実現されていることがわかった。以上の知見は、三量体G蛋白質とレセプター蛋白質の一般的な機能発現メカニズムの解明にとっても非常に意義深いものである。これらの知見をより深めるため、現在Gtのγサブユニット及びロドプシンキナーゼのC末端領域の脂質修飾ペプチドを合成している。

In this study, we aim to elucidate the mechanism of protein-protein interaction under physiological conditions. Spectrophotometry with high performance CCD for detection and detection is applicable to the measurement of absorbance in different time fields. The light absorption and decomposition of the active intermediate, the formation of the active intermediate, and the decomposition of the active intermediate can be obtained. The physiological sample conditions were determined by the measurement of the retinal outer segment membrane (ROS membrane). For the determination of absorbance, the ROS membrane suspension is difficult to detect. The ultrasonic wave breaking method is introduced into the physiological conditions to ensure the turbidity of the low medium sample. This method is successful in determining the temperature of the sample in vivo and in determining the equilibrium of the precursor. The sample was purified from Gt, Gt and Gt by non-aqueous decomposition. The absorbance of Gt was determined by the unique binding of Gt, Gt and Gt. The interaction between Gt and Gt was determined by the unique binding of Gt and Gt. Gt and gdp are added to the sample and the interaction between them and gdp is studied. The above findings are of great significance to the general functional development of three-dimensional G proteins. The lipid modification in the C-terminal domain of the Gt gene was synthesized in the following ways: