特異的DNA配列固定化磁性細菌粒子を用いた自動同定装置の構築及び、その工学的応用

固定特定DNA序列磁性细菌颗粒自动识别装置的构建及其工程应用

• 批准号: 00J04770
• 负责人: 中山 秀喜
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J04770/
• 关键词: ハイブリダイゼーション; 蛍光検出; 塩基差異; DNA検出; FRET

これまでに磁性細菌が生産するバイオナノ磁性粒子(Bacterial Magnetic Particle ; BMP)をDNAの固定化担体とし、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を用いることにより、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の一塩基多型の識別が可能であることを示してきた。ここではGC含量が76%と高い、骨粗鬆症関連遺伝子TGF-β1の一塩基多型の識別を試みた。ビオチン標識架橋剤(Sulfo-LC-LC-biotin)を用いてBMP上にストレプトアビジンを導入し、ストレプトアビジン固定化粒子(SA-BMP)を作製した。一方、血液より抽出したDNAをテンプレートとし、ビオチン標識プライマーを用いてPCRによりTGF-β1遺伝子の増幅断片(139bp)を調製した。正常サンプルをTGF-β1*1型とし、1塩基変異を含む不活性型サンプルをTGF-β1*2型とした。得られたビオチン標識PCR産物をSA-BMPを用いて回収し、磁気分離により未回収のPCR産物の除去を行った。その後FITC標識された各検出プローブ10pmolと、DNAインターカレータPOPO-3(1μM)を加えて、熱変成5分、ハイブリダイゼーション10分を行った。反応槽の底面にて磁気分離をした後、上清の蛍光強度(Ex./Em.=490/570nm)の測定を行った。PCR bufferに15%グリセロールを加えることでTGF-β1遺伝子の増幅は認められたが、その増幅された断片に対して、FRETによるSNPの検出を行ったところFRETに由来する蛍光が得られなかった。これはターゲットDNAのGC含量が高いため、熱変性による一本鎖DNAの調製が困難であることが考えらえた。そこで検出時に用いるBufferに対してPCRと同様に15%グリセロールを加えて検出を行った結果、FRETに由来する弱いシグナルが検出された。これはターゲットDNAにハイブリダイズしている検出プローブの量が少ないために、得られる蛍光強度が低いと考えられた。さらに検出プローブとのハイブリダイゼーション時に用いるbufferについて検討を行った結果、15%グリセロールを含む検出bufferに8% DMSO、4% Formamideを加えることで、FRETに由来する蛍光強度の増加が示された。

This is the first time that magnetic bacteria have been used to produce magnetic particles (Bacterial Magnetic Particles (BMP)) and DNA immobilization supports, and the use of optical resonance transfer (FRET). The GC content was 76%, and the identification of TGF-β1, a protein associated with osteoporosis, was attempted. Sulfo-LC-LC-biotin is used to prepare immobilized particles (SA-BMP) on BMP. A fragment (139bp) of TGF-β1 gene was modulated by PCR. Normal TGF-β1*1 type, 1 * 2 type, and inactive TGF-β1*2 type The PCR products were identified by SA-BMP and removed by magnetic separation. After the FITC labeling, each sample was tested by 10pmol of DNA, POPO-3(1μM), 5 minutes of heat, and 10 minutes of heat. The magnetic separation of the bottom of the anti-groove and the luminous intensity of the supernatant (Ex./ Em.= 490/570nm). PCR buffer 15% increase in the amplitude of TGF-β1 gene expression, increase in the amplitude of SNP expression, FRET gene expression, FRET gene expression The GC content of DNA is high, and the temperature is low. The Buffer is used to detect PCR and identity 15% of the time. The buffer is used to detect the result of FRET. The amount of light emitted by the light source is low. When the detection buffer is used, the detection result is 15% and the detection buffer is 8% DMSO and 4% Formamide. The increase in the intensity of FRET is shown.

项目成果

H.Ota, H.Takeyama, H.Nakayama, T.Katoh, T.Matsunaga: "SNP Detection in Transforming Growth Factor-β1 Gene Using Bacterial Magnetic Particles"Biosens Bioelectron. (in press).

H.Ota、H.Takeyama、H.Nakayama、T.Katoh、T.Matsunaga：“使用细菌磁性粒子检测转化生长因子-β1 基因的 SNP”Biosens Bio Electron（正在出版）。