プロテインチップに用いる新しい蛍光検出反応の開発

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本研究代表者らは、最近、カテコールとホウ酸塩がペプチドのN末端アミノ酸のアミノ基と隣接ペプチド結合を認識して蛍光を発する現象を見出した。昨年度の研究では、この蛍光現象を化学的に解析し、ペプチドホルモンに対する特異的な高感度蛍光検出反応を開発した。この蛍光反応は、ペプチドに対して抗原抗体反応に匹敵する特異性を有し、複雑な試料から微量ペプチドホルモンを光学的に検出できるものであり、高価なモノクローナル抗体や特種な反応装置を必要としないものである。そこで、本年度の研究では、この蛍光反応を、ペプチドホルモンのプロテインチップ系の高感度検査法としての適応化を試みた。まず、タンパク質の安価な吸着膜であるPVDF膜に吸着させたインスリンペプチドの蛍光反応の最適条件の検討を行った。その結果、膜に吸着させたタンパク質、インスリン抗体及びウシ血清アルブミンを有機溶媒(メタノールまたはメチルセロソルブ)の変性作用により、タンパク質に比べ変性の影響の少ないインスリンを選択的に蛍光検出できることが分かった。さらに、膜をシャーレー中に浸し、カテコール、NalO_4、及びホウ酸塩(pH8)を加えて、インスリンを定量的に蛍光体に変換する諸条件を検討した結果、数ピコモルレベルのインスリンを定量できた。この感度は血液中のインスリンを測定するには不十分であるが、開発した方法は、検体抽出液を濃縮することによって、各種の生理活性ペプチドを、チップアレイ上で、一斉に検出できる新たな手法を提供できるものである。