黄色ブドウ球菌の産生するロイコシジンのヒト好中球崩壊機構の解明

黄色ブドウ球菌の産生する白血球崩壊毒素ロイコシジン(Luk)はLukS、LukFからなり、ヒト及びウサギ白血球を特異的に崩壊する。崩壊活性の発現にはLukSのリン酸化、及び両成分による膜孔形成が必須である。本研究はLukの白血球崩壊機構の全容を解明することを目的とする。そこで最終年度である本年度は以下のことを行った。1.LukS reseptorのスクリーニング前年度までに酵母を用いたtwo-hybrid systemにおいてLukSのリン酸化部位を含むC末端領域をプローブとして、このLukSに結合性を示すクローンをヒト末梢血白血球cDNA libraryからスクリーニングした結果、toll-like receptor 4の細胞外ドメインに結合する膜表層タンパク質MD-2を取得した。MD-2をコードするcDNAをpET-22b(+)にクローニングし、大腸菌を形質転換し、C末端にHis-tagを付加させたMD-2(MD-2-6His)を発現させた。現在、MD-2-6Hisを精製し、LukSとのin vitroでの結合を検討中である。2.Lukのヒト白血球崩壊活性に対するraftの関与の検討LukSのヒト白血球の認識にGM1が関与すること、及び白血球に結合したLukSが非イオン性界面活性剤によって可溶化されないことから、Lukのヒト白血球崩壊活性に細胞膜マイクロドメインraftが関与していることが示唆された。そこで、raftを崩壊させるmethyl-β-cyclodextrin(MBCD)の効果を検討したところ、MBCDによってLukの活性が阻害された。また、毒素処理したヒト白血球をBrij 35で可溶化した後、lysateをショ糖密度勾配法で分画した結果、毒素成分がraftの含まれる画分に分画された。以上の結果、Lukのヒト白血球崩壊活性にraftが関与している可能性が強く示唆された。

黄色ブドウ球菌の産生する白血球崩壊毒素ロイコシジン(Luk)はLukS、LukFからなり、ヒト及びウサギ白血球を特異的に崩壊する。崩壊活性の発現にはLukSのリン酸化、及び両成分による膜孔形成が必須である。本研究はLukの白血球崩壊機構の全容を解明することを目的とする。そこで最終年度である本年度は以下のことを行った。1.LukS reseptorのスクリーニング前年度までに酵母を用いたtwo-hybrid systemにおいてLukSのリン酸化部位を含むC末端領域をプローブとして、このLukSに結合性を示すクローンをヒト末梢血白血球cDNA libraryからスクリーニングした結果、toll-like receptor 4の細胞外ドメインに結合する膜表層タンパク質MD-2を取得した。MD-2をコードするcDNAをpET-22b(+)にクローニングし、大腸菌を形質転換し、C末端にHis-tagを付加させたMD-2(MD-2-6His)を発現させた。現在、MD-2-6Hisを精製し、LukSとのin vitroでの結合を検討中である。2.Lukのヒト白血球崩壊活性に対するraftの関与の検討LukSのヒト白血球の認識にGM1が関与すること、及び白血球に結合したLukSが非イオン性界面活性剤によって可溶化されないことから、Lukのヒト白血球崩壊活性に細胞膜マイクロドメインraftが関与していることが示唆された。そこで、raftを崩壊させるmethyl-β-cyclodextrin(MBCD)の効果を検討したところ、MBCDによってLukの活性が阻害された。また、毒素処理したヒト白血球をBrij 35で可溶化した後、lysateをショ糖密度勾配法で分画した結果、毒素成分がraftの含まれる画分に分画された。以上の結果、Lukのヒト白血球崩壊活性にraftが関与している可能性が強く示唆された。