神経細胞の形態変化を捉える発現スクリーニングによる回路形成に働く拡散性分子の探索

通过捕获神经细胞形态变化的表达筛选，寻找在回路形成中发挥作用的可扩散分子

基本信息

批准号：
12053272
负责人：
玉田篤史
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではニューロンの形態変化を指標とした機能アッセイ系を用いた遺伝子発現スクリーニング法により、回路形成・成熟過程で働く拡散性分子を系統的に探索することを目的としている。アッセイ系の概略は、ライブラリーからのcDNAを導入した株細胞の凝集塊を作り、それと単離したニューロンを混ぜて、拡散性分子の濃度勾配を再現できるコラーゲンゲル内に包埋して共培養し、ニューロンの形態変化(特に突起伸長の方向性)を検出するものである。本研究では、まず、既知分子のcDNAを用いて、リポフェクション法の最適条件、分割するプールの数等を決める予備実験を行った。拡散性反発分子slit2,semaphorin3F cDNA導入細胞塊と視床上部、海馬、嗅球から単離した細胞との共培養で、組織片だけでなく単離細胞でも実際に形態変化が検出可能であることを確認した。さらに゜、実際のスクリーニングでは100個以上の異なるcDNAを混ぜてアッセイに用いることになるため、1/100のcDNA量でも形態変化を検出できることが必要とされる。その点について、導入するcDNA量を1/100にして同様のアッセイを行い、微量のcDNA量でも形態変化が検出出来ることを確認した。これらの予備実験の結果を踏まえて、ラット胎児脳組織よりcDNAライブラリーを作成し、このライブラリーを上記のアッセイ系を用いてスクリーニングする作業を開始し、現在拡散性分子の探索を進行中である。

这项研究旨在通过使用基因表达筛选方法使用功能分析系统，使用神经元形态变化作为指标来系统地搜索在电路形成和成熟过程中作用的扩散分子。测定系统的轮廓是形成与文库中cDNA引入的细胞系的聚集体，混合孤立的神经元，并嵌入胶原蛋白凝胶中，这些胶原凝胶可以重现可扩散分子的浓度梯度，并共培养以检测神经元的变化（尤其是突出的方向）。 In this study, we first conducted a preliminary experiment using cDNAs of known molecules to determine the optimum conditions for lipofection, the number of pools to be divided, etc. Diffusion repulsion molecules slit2 and semaphorin3F When co-cultured with cDNA-introduced cell masses and cells isolated from the superthalamus, hippocampus, and olfactory bulb, we confirmed that morphological changes can实际上不仅在组织碎片中，而且在孤立的细胞中被检测到。此外，在实际筛选中，将在测定中混合和使用100多种不同的cDNA，因此即使在1/100的cDNA量下，也必须能够检测形态变化。在这方面，进行了相同的测定，以确定即使将少量cDNA引入1/100的量，并且可以检测到形态的变化。根据这些初步实验的结果，我们已经开始使用上述测定系统从胎儿大鼠脑组织创建一个cDNA库，并筛选了该文库，目前正在搜索可扩散的分子。