神経細胞の形態変化を捉える発現スクリーニングによる回路形成に働く拡散性分子の探索

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本研究ではニューロンの形態変化を指標とした機能アッセイ系を用いた遺伝子発現スクリーニング法により、回路形成・成熟過程で働く拡散性分子を系統的に探索することを目的としている。アッセイ系の概略は、ライブラリーからのcDNAを導入した株細胞の凝集塊を作り、それと単離したニューロンを混ぜて、拡散性分子の濃度勾配を再現できるコラーゲンゲル内に包埋して共培養し、ニューロンの形態変化(特に突起伸長の方向性)を検出するものである。本研究では、まず、既知分子のcDNAを用いて、リポフェクション法の最適条件、分割するプールの数等を決める予備実験を行った。拡散性反発分子slit2,semaphorin3F cDNA導入細胞塊と視床上部、海馬、嗅球から単離した細胞との共培養で、組織片だけでなく単離細胞でも実際に形態変化が検出可能であることを確認した。さらに゜、実際のスクリーニングでは100個以上の異なるcDNAを混ぜてアッセイに用いることになるため、1/100のcDNA量でも形態変化を検出できることが必要とされる。その点について、導入するcDNA量を1/100にして同様のアッセイを行い、微量のcDNA量でも形態変化が検出出来ることを確認した。これらの予備実験の結果を踏まえて、ラット胎児脳組織よりcDNAライブラリーを作成し、このライブラリーを上記のアッセイ系を用いてスクリーニングする作業を開始し、現在拡散性分子の探索を進行中である。