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皮膚三次元培養モデルにおけるヒトパピローマウイルス複製機構の解析

三维皮肤培养模型中人乳头瘤病毒复制机制分析

基本信息

批准号：
12213061
负责人：
酒井博幸
金额：
$ 3.01万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12213061/
关键词：
パピローマウイルスウイルス発がんテロメラーゼ細胞周期

项目摘要

1.HPV陽性癌細胞におけるE6/E7発現の意義に関する研究.HPV陽性癌細胞としてはHeLaやSiHa、Caski細胞を用いた。これらの細胞内では活性を有するE6/E7の発現が認められ、この研究ではHPV16由来のE2を発現させることでE6/E7のプロモーター活性を抑え、その効果を検討した。HPV陽性癌細胞でE6/E7の発現を抑えると細胞増殖が抑制され、この抑制はE7の発現を補うことで解除された。しかしE6の発現は細胞の増殖性には影響しないことが分かった。E7の機能として、RBファミリー蛋白と相互作用してその機能を阻害する活性が知られている。E7の変異体を用いることで、ここで見られた細胞増殖に対する効果にはE7-RB相互作用が重要であることを示した。増殖停止した細胞がsenescenceの状態にあることが確認されたので細胞内のtelomerase活性を評価したところ、E7の発現低下と共にtelomerase活性が抑制されることを見出した。E7発現低下による細胞増殖抑制がtelomerase活性を補うことで部分的に解除されることから、細胞の増殖性の維持機構にtelomerase活性、あるいはtelomere構造が関わっていることが示唆された。2.HPV E4遺伝子機能の解析.ハイリスク型のHPV由来のE4遺伝子をHeLa細胞内に発現させるとG2期の細胞集団の増加と細胞増殖性の低下が認められた。同様の活性を持つことが知られるHIV-1のVprの活性と比較してみると、ほぼ同程度の活性を持つことが分かった。増殖停止した細胞では有意のapoptosisは検出されなかったが、BrdUの取り込みなどの解析からDNA合成のre-entryが起こっていることが確認された。E4とGFPとの融合タンパクは既に報告されているサイトケラチンの崩壊を引き起こす活性を保持しているが、細胞周期への影響を失っていた。このことはこれらの2つの活性が独立した機序を持つことを示している。3.皮膚三次元培養モデルにおけるHPV DNA複製機構の解析.ヒトの初代培養角化細胞(keratinocyte)を用いて皮膚モデルを構築し、その培養系においてHPV DNAの複製を再現した。ウイルスDNAはHPV18をもとに作成したplasmid状の構造を持つもので、同じDNAからblasticidin S耐性遺伝子を発現するものである。このplasmidを角化細胞に導入し、薬剤選択を行った後に皮膚モデルの構築を行うとウイルスDNAのコピー数の増大が観察された。今後はこの系をもとにして必要な遺伝子やcisエレメントの同定を行う予定である。

1. Research on the significance of the emergence of HPV-positive cancer cells E6/E7. Research on the use of HPV-positive cancer cells such as HeLa and SiHa and Caski cells.これらのActivity in cells has するE6/E7 の発 appear がidentification められ, この research ではHPV16 by Come to the E2 を発 appear させることでE6/E7 のプロモーターActive を suppress え, そのeffect を検To した. HPV-positive cancer cells can inhibit the growth of E6/E7 cells and relieve the inhibition of E7. The proliferative nature of the cells affected by E6's appearance is divided into two parts. The functions of E7 and RB protein are the same as the interaction function and the blocking activity of the protein. The effect of E7 allogeneic use on cell proliferation and the importance of E7-RB interaction are demonstrated. Proliferation has stopped, the state of the cell has stopped, and the status of the cell has been confirmed. The activity of E7 is low and the activity of telomerase is suppressed. E7 appears to be partially relieved by inhibiting cell proliferation and telomerase activity by replenishing and repairing the cell proliferation. The proliferative maintenance mechanism is telomerase activity, and the telomere structure is closed. 2.HPV Analysis of the function of E4 legacy. The origin of HPV type E4. The presence of intracellular abnormalities indicates the increase in cell mass in the G2 phase and the decrease in cell proliferation. The activity of the same degree is the same as the activeness of HIV-1, and the activity of HIV-1 is relatively high. Proliferation has stopped, cells have stopped and BrdU has stopped.り込みなどのanalyticsからDNA synthesisのre-entryが开こっていることがconfirmationされた. E4とGFP and fusion タンパクはJiに report されているサイトケラチンのcollapse壊をinduced the こすactivity をmaintenance しているが, the cell cycle へのeffect をlost っていた.このことはこれらの2つのACTIVITY がINDEPENDENT したMechanical sequence をhold つことをshow している. 3. Analysis of the DNA replication mechanism of HPV in three-dimensional skin culture. The primary culture of keratinocytes was constructed using the skin three-dimensional culture system, and the culture system of HPV was constructed. The reproduction of DNA is the reproduction of DNA.ウイルスDNAはHPV18をもとに成したplasmid-like のstructural をhold つもので, same as じDNA からblasticidin S resistant legacy 伝子を発appears するものである. After the plasmid is introduced into the keratinocytes, the skin is selected and used.モデルのconstruct を行うとウイルスDNA のコピーnumber のincrease large が観看された. From now on, it is necessary to do the necessary work for the future.