Axamノックアウトマウスの作製とその解析

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体軸形成等の発生分化や発癌に関与するWntシグナル伝達系において中心的な役割を果たす分子群であるβカテニン、APC、GSK-3βというタンパク質と会合するAxinは、さらにAxam(Axin Associated Molecule)という分子に会合する。そこで我々はこのAxamが発生分化のコントロールや発癌に対してどのような作用を有するかを調べるため、Axamノックアウトマウスを作製し、その表現型を調べることを目的としている。ノックアウトマウスは、Axamゲノム遺伝子より機能領域を欠失させるターゲティングベクターを構築した。これをES細胞にトランスフェクションしてAxam遺伝子の相同組換え体をPCRにてスクリーニングする方法を確立し、相同組換えはサザンブロッティングで確認した。そのES細胞をマウス胚盤胞にマイクロインジェクションした。この胚を偽妊娠させた仮親の子宮に移植し、キメラマウスを得、さらにキメラマウスとC57B1/6マウス(野生型)を交配し、Axam遺伝子の一つのアリルが変異したマウス(Axamヘテロノックアウトマウス)を作製し、現在ヘテロマウス同士を交配することによってノックアウトマウスの作製を試みている。また、Axamは、そのC末端側にSUMO化を引き起こす酵素に類似のアミノ酸配列を持つことが明らかになった。そこで、マウスcDNAを哺乳類発現ベクターに組み込み過剰発現によって、SUMO化が促進するかどうか、すでにSUMO化されることが明らかとなっているp53を基質に調べた。また、大腸菌における蛋白産生ベクターにAxamのマウスcDNAを組み込み、大腸菌でAxam蛋白を産生精製することを試みた。この精製蛋白とp53を試験管内で混合することによって、試験管内SUMO化反応の構築を試みた。