膜蛋白質複合体形成機構の解析

膜蛋白复合物形成机制分析

• 批准号: 01J00645
• 负责人: 川渕 真大
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J00645/
• 关键词: lipid raft; CD9; HB-EGF; Two-Hybrid; SARM; DIM; システイン; パルミチン酸

HB-EGF、CD9の細胞内領域を用いてYeast Two-Hybrid法を用いてスクリーニングを行った。HB-EGFを用いたスクリーニングから、新規蛋白質SAM and β-Cat/Armadillo motifs (SARM)のスクリーニングに成功した。HB-EGFはEGFレセプターのリガンドであるが、はじめは膜蛋白質として合成され、ある種の刺激によってsheddingを受けて細胞外領域が放出されレセプターに作用する。sheddingを受ける前の膜結合型も単なる前駆体ではなくある種の活性を持っているのではないかと考えられている。私は、膜型および遊離型HB-EGFとSARMの関係を調べる過程で以下のことを明らかにした。1)SARMを293細胞より精製し、マス解析にかけることによってSARMの翻訳開始点を決定した。その結果、これまでデータベースに記載されていたSARMの配列が間違いであることを確認した。SARMに関する論文のなかで、アミノ酸配列から構造を予測した結果、β-Cateninに類似するとの報告があったが、新たに確認した配列を構造予測プログラムにかけたところ、β-Cateninとは異なると判断した。2)ノザンブロット及び、抗体染色からSARMは神経細胞に発現が多いことを確認した。3)HB-EGFの細胞内領域とSARMの結合部位を検討した結果、SARMのC末端付近に存在するTIRドメインとHB-EGFが親和性が高いことを確認した。4)HB-EGFは、はじめに膜蛋白質として合成され、ある種の刺激によってsheddingを受け、細胞外領域はEGFレセプターに作用し、細胞内領域は核へ移行してシグナルを伝えると考えられている。そこで、SARMはHB-EGFとともに核へ移行し、何らかのシグナルを伝達するのではないかと考えた。Vero-H細胞にSARMを強制発現させ、TPAなどsheddingを生じる刺激を与えてみたが、HB-EGFのC末端とともにSARMが核に移行するという現象は確認できなかった。5)COS細胞においてHB-EGFをSARMと共に強制発現すると、HB-EGFを単独で強制発現した時と比較して、細胞でのHB-EGFの量が多くなるとともに、sheddingを受けて培地中に放出されるHB-EGFの量も多くなることを確認した。このことより、SARMはHB-EGFのシグナルを増強する役割を有する可能性が示唆された。

HB EGF, CD9 を の cell field with い て Yeast Two Hybrid method を with い て ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. HB EGF を - use い た ス ク リ ー ニ ン グ か ら, new rules protein SAM and beta Cat/Armadillo motifs (SARM) の ス ク リ ー ニ ン グ に successful し た. HB EGF は EGF - レ セ プ タ ー の リ ガ ン ド で あ る が, は じ め は membrane protein と し て synthetic さ れ, あ る kind の stimulation に よ っ て shedding を by け て extracellular domain が release さ れ レ セ プ タ ー に role す る. Before shedding を by け る の type membrane bound も 単 な る 駆 body before で は な く あ る の activity を hold っ て い る の で は な い か と exam え ら れ て い る. Private は, membrane type お よ び free type of HB EGF - と SARM の masato is を adjustable べ る process under で の こ と を Ming ら か に し た. 1) SARM を 293 cells よ り refined し, マ ス parsing に か け る こ と に よ っ て SARM の turn 訳 を decided to start し た. そ の results, こ れ ま で デ ー タ ベ ー ス に recorded さ れ て い た SARM の match between column が violations い で あ る こ と を confirm し た. SARM に masato す る paper の な か で, ア ミ ノ acid with column か ら tectonic を be し た results, beta - Catenin に similar す る と の report が あ っ た が, new た に confirm し た を structure with column can be プ ロ グ ラ ム に か け た と こ ろ, beta - Catenin と は different な る と judgment し た. 2)ノザ ブロット ブロット and び, as well as antibody staining of らSARM and に of neural cells, are found to be が multiple, <s:1> とを とを, confirming that た た. 3) HB - EGF の intracellular domain と SARM の combining site を beg し 検 た results, SARM の C end paying nearly に exist す る TIR ド メ イ ン と HB EGF が - high affinity が い こ と を confirm し た. 4) HB EGF は, は じ め に membrane protein と し て synthetic さ れ, あ る kind の stimulation に よ っ て shedding を け, extracellular domain は EGF レ セ プ タ ー し に action, the cell area は nuclear へ transitional し て シ グ ナ ル を 伝 え る と exam え ら れ て い る. そ こ で, SARM は HB EGF - と と も に nuclear へ transitional し, ら か の シ グ ナ ル を 伝 da す る の で は な い か と exam え た. Vero cells - H に SARM を forced 発 now さ せ, TPA な ど shedding を raw じ る stimulus を and え て み た が, HB EGF の C terminal と と も に SARM が nuclear に transitional す る と い う phenomenon は confirm で き な か っ た. 5) COS cell に お い て HB EGF - を SARM と に forced 発 now total す る と, HB EGF を 単 alone で forced 発 now し た と more し て, cell で の HB - the amount of EGF の が more く な る と と も に, shedding を by け て in petty に release さ れ る HB - the amount of EGF の も more く な る こ と を confirm し た. There is a する possibility that が indicates された the enhanced する operation を of <s:1> とよ とよ, SARM する HB-EGF シグナ シグナ を を を.