ビタミンD_3の代謝に関わる酵素の構造と機能に関する研究

维生素D_3代谢相关酶的结构与功能研究

• 批准号: 01J03408
• 负责人: 澤田 夏美
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J03408/
• 关键词: ビタミンD; シトクロムP450; 大腸菌発現系; ビタミンD水酸化酵素; 代謝予測; 部位特異的変異

(1)ヒト由来ビタミンD_3 24位水酸化酵素(CYP24)によるビタミンD_3透導体の代謝ヒト由来CYP24を大腸菌で発現させ、活性を上昇させるために電子供与体との同時発現を試みた。菌体培養液あるいは膜画分に、副甲状腺亢進症の治療薬であるビタミンD_3-ヘキサフルオロ体を添加し、代謝産物をHPLCおよび質量分析計により分析した。その結果、ヘキサフルオロ体は23S位水酸化体、続いて23位オキソ体、さらに構造未知の代謝物へと変換されること、別の代謝経路として側鎖が切断され完全に不活化されることが明らかになった。23S位水酸化に始まる代謝経路の最後の代謝物はラット由来CYP24には見られず、動物種差が認められた。(2)ヒト由来CYP27A1の基質特異性の改変くる病患者由来CYP27B1(ビタミンD_31α位水酸化酵素)変異型酵素の解析およびコンピューターモデリングにより予測したCYP27B1の立体構造からCYP27B1のGln65が基質25-ヒドロキシビタミンD_3[以下25(OH)D_3]との結合に関与することが示唆された。一次構造上の相同性が40%で25(OH)D_3の1α位水酸化活性を有するCYP27A1(ビタミンD_325位水酸化酵素)についてCYP27B1のGln65に相当するGln85の変異体を作製し,その性質を調べた。正常型CYP27A1は25(OH)D_3の1α位,24位および26位の3箇所を水酸化し、その活性はそれぞれ10,8,26(mmol/min/P450)であり、Q85Hでは,0,20,4(mmol/min/mol P450)であった。これらの結果からCYP27B1のGln65,CYP27A1のGln85は1α位水酸化活性において重要な役割を果たすことがわかった。また,CYP27A1のGln85は1α位水酸化活性とは異なる結合様式で発揮される25(OH)D_3の側鎖の水酸化にも関与することがわかった。

(1) ヒ ト origin ビ タ ミ ン D_3 24 acidic enzyme (CYP24) に よ る ビ タ ミ ン D_3 transparent conductor の metabolic ヒ ト origin CYP24 を coliform で 発 now さ せ rising, active を さ せ る た め に electronic body and supply と の also 発 を now try み た. Bacteria culture あ る い は membrane draw points に, parathyroid gland beat の treatment 薬 で あ る ビ タ ミ ン D_3 - ヘ キ サ フ ル オ ロ を add し, metabolites を HPLC お よ び quality analysis meter に よ り analysis し た. そ の results, ヘ キ サ フ ル オ ロ は 23 s a water acidification, 続 い て 23 オ キ ソ body, さ ら に construct unknown の metabolites へ と variations in さ れ る こ と, metabolic 経 don't の way と し て side chain が cut さ れ に completely inactive さ れ る こ と が Ming ら か に な っ た. 23 s beginning a water acidification に ま る metabolic 経 の eventually の metabolites は ラ ッ ト origin CYP24 に は see ら れ ず, animal differentiae が recognize め ら れ た. (2) ヒ ト origin CYP27A1 の substrate specificity の change - く る disease origin CYP27B1 (ビ タ ミ ン D_31 alpha acidic enzyme) - different enzyme の parsing お よ び コ ン ピ ュ ー タ ー モ デ リ ン グ に よ り be し た CYP27B1 の three-dimensional structure か ら CYP27B1 の Gln65 が matrix 25 ヒ ド ロ Youdaoplaceholder0 と D_3[25(OH)D_3]と キシビタ combine the に relation with する された とが とが suggest された. A gay が 40% で の in its construction phase of 25 (OH) D_3 の alpha 1 bit water acidification active を す る CYP27A1 (ビ タ ミ ン D_325 acidic enzyme) に つ い て CYP27B1 の Gln65 に quite す る Gln85 の - し the を cropping, そ の nature を adjustable べ た. Normal type CYP27A1 は 25 (OH) D_3 の 1 alpha, 24 お よ び 26 の を by three water acidification し, そ の active は そ れ ぞ れ 10,8,26 (the tendency for min/P450) で あ り, Q85H で は, 0,20,4 (the tendency for min/mol P450) で あ っ た. こ れ ら の results か ら CYP27B1 の Gln65, CYP27A1 の Gln85 は alpha 1 bit acidic active に お い て important な "を cut fruit た す こ と が わ か っ た. ま た, CYP27A1 の Gln85 は alpha 1 bit acidic active と は different な る combined with others in type で 発 swing さ れ る 25 (OH) D_3 の side chain の water acidification に も masato and す る こ と が わ か っ た.

项目成果

Sakaki, T., Sawada, N.et al.: "Metabolism of 26,26,26,27,27,27-F6-1α,25-dihydroxyvitamin D_3 by CYP24"Biochemical Pharmacology. (in press). (2003)

Sakaki, T., Sawada, N. 等人：“CYP24 的 26,26,26,27,27,27-F6-1α,25-二羟基维生素 D_3 的代谢”（Biochemical Pharmacology）（2003 年出版）。