嫌気性廃水処理における微生物の生態-分子情報を活用した分離困難な微生物の培養-

厌氧废水处理中微生物的生态学 - 利用分子信息难以分离的微生物的培养 -

• 批准号: 01J04157
• 负责人: 井町 寛之
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J04157/
• 关键词: 高温性嫌気性処理; プロピオン酸; 嫌気共生細菌; fluorescence in situ hybridization(FISH); Desulfotomaculum; real-time PCR

本研究は次世代型の省エネルギー・創エネルギー型有機性廃水技術として現在注目を集めている55℃付近で運転する高温嫌気性処理プロセスに着目した。本プロセスは実用化するためにはいくつかの問題を抱えており、特にその運転が不安定になった際にプロピオン酸がプロセス内に著しく蓄積してしまい、良好な処理が望めなくなることが大きな問題の1つである。そこで本研究では、このプロピオン酸の蓄積問題を解決する糸口として、高温嫌気環境下でプロピオン酸を分解する微生物に焦点を当て、その微生物の詳細な菌学的特徴の決定およびプロピオン酸を分解する微生物の多様性の調査および検出・定量方法を確立した。まず、本研究に先立って私が世界に先駆けて分離した高温性嫌気プロピオン酸酸化共生細菌SI株の菌学的特徴の決定を行った。SI株蛛の至適生育温度は55℃であり、至適生育pHは7.0であることを明らかにした。基質利用性試験によりSI株はプロピオン酸以外に乳酸やエタノールなどのアルコール類をMethanothermobacter thermautotrophicus Hとの共生で利用でき、ピルビン酸とフマル酸で単独に生育可能であることを明らかにした。また、SI株の16S rDNAを決定し、分子系統解析を行ったところ、硫酸還元細菌であるDesulfotomaculum属に属することを明らかにした。しかしながら、SI株は硫酸還元能を欠いていること、SI株の持つキノン種はMK-7およびMK-7(H_4)であり、Desulfotomaculum属のそれとは異なること、SI株は硫酸還元の代わりにフマル酸還元をすることが明らかとなった。これらの解析結果から、SI株を新属新種Pelotomaculum thermopropionicumとして提案した。次に上記の解析より得られたSI株の菌学的特徴と新たに16S rRNA遺伝子配列を基に分子系統解析を行った結果から、SI株の属するDesulfotomaculum subcluster Ihグループ硫酸還元能を持たず、分離培養が困難な嫌気共生細菌群で構成されている可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、様々な環境中のDesulfotomaculum subcluster Ihに属する細菌の多様性解析および分離培養等を行った。その結果、嫌気メタン生成環境下では、Desulfotomaculum 属の中でも特にsubcluster Ihに属する細菌が多く存在していることを明らかにし、subcluster Ihに属する新規のプロピオン酸酸化共生細菌を高温性で2株、中温性で3株を培養することに成功した。これらの多様性解析と培養等の結果から、Desulfotomaculum subcluster Ihは嫌気共生細菌で構成され、様々なメタン発酵プロセスに広く存在していることを明らかとなった。さらには、Desulfotomaculum subcluster Ih細菌群を検出・定量を可能にするためにsubclsuter Ih細菌群の16S rRNAを標的としたDNAプローブを作成し、環境中のsubcluster Ih細菌をFISH(fluorescence in situ hybridization)法により検出可能にし、real-time PCR法を用いることで定量方法を確立した。

This study focuses on the next generation of organic wastewater treatment technology, which focuses on high temperature treatment near 55℃. The problem of this problem is that it is difficult to handle it properly. In this study, the focus of microorganisms on acid decomposition under high temperature and high humidity environment was studied, and detailed bacteriological characteristics of microorganisms were determined. Methods for investigating and quantifying the diversity of microorganisms on acid decomposition were established. In this study, we first isolated and characterized SI strains of thermophilic symbiotic bacteria from the world. The optimum growth temperature of SI spider is 55℃, and the optimum growth pH is 7.0 ℃. The substrate utilization test indicates that the SI strain has the ability to reproduce independently of the acid. 16S rDNA analysis, molecular phylogenetic analysis, sulfate reduction bacteria, genus Desulfotomaculum SI strain is resistant to sulfuric acid reduction, SI strain is resistant to sulfuric acid reduction, and SI strain is resistant to sulfuric acid reduction. MK-7(H_4) is resistant to sulfuric acid reduction. Desulfotomaculum is resistant to sulfuric acid reduction. A new genus and species of Pelotomaculum thermopropionicum was proposed. The results of molecular phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence of the SI strain were reported. The results showed that the ability of sulfuric acid reduction of the SI strain was maintained, and the possibility of formation of the difficult symbiotic bacteria group was established. This paper describes the identification, analysis and isolation of bacterial diversity in Desulfotomaculum subcluster Ih. As a result, the number of bacteria belonging to the genus Desulfotomaculum in the medium and subcluster Ih of the genus Desulfotomaculum was increased. Two strains of acid-forming symbiotic bacteria with high temperature and three strains with moderate temperature were successfully cultured. The results of diversity analysis and culture showed that Desulfotomaculum subcluster Ih was composed of symbiotic bacteria, and that there was no difference between them. In addition, the detection and quantification of Desulfotomaculum subcluster Ih bacteria can be achieved by using FISH(fluorescence in situ hybridization) method and real-time PCR method.

项目成果

Chen, A.-C., Imachi, H., Sekiguchi, Y., Ohashi, A., Harada, H.: "Archaeal community composition at different depth(up to 30 m)of a municipal solid waste landfill in Taiwan as revealed by 16S rDNA cloning analyses"Biotechnology Letters. (in press). (2003)

Chen, A.-C.、Imachi, H.、Sekiguchi, Y.、Ohashi, A.、Harada, H.：“台湾城市固体废物填埋场不同深度（最多 30 m）的古菌群落组成为

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, S.Hanada, A.Ohashi, H.Harada: "Pelotomaculum thermopropionicum gen. nov., sp. nov., an anaerobic, thermophilic, syntrophic propionate-oxidizing bacterium"International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 5

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, S.Hanada, A.Ohashi, H.Harada：“Pelotomaculum thermopropionicum gen. nov., sp. nov.，一种厌氧、嗜热、互养丙酸氧化细菌”国际

井町寛之, 関口勇地, 鎌形洋一, 大橋晶良, 原田秀樹: "高温嫌気性廃水処理汚泥から分離したプロピオン酸酸化共生細菌の生理学的特徴とグラニュール汚泥内空間分布"水環境学会誌. 25. 539-546 (2002)

Hiroyuki Imachi、Yuji Sekiguchi、Yoichi Kamagata、Akira Ohashi、Hideki Harada：“从高温厌氧废水处理污泥中分离出的丙酸氧化共生细菌的颗粒污泥内的生理特征和空间分布”日本水环境学会杂志25。 539-546（2002）

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, A.Ohashi, H.Harada: "Cultivation and in situ detection of a thermophilic bacterium capable of oxidizing propionate in syntrophic association with hydrogenotrophic methanogens in a thermophilic methanogenic granular slu

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, A.Ohashi, H.Harada：“在嗜热产甲烷颗粒泥中与氢营养型产甲烷菌互养关联的能够氧化丙酸的嗜热细菌的培养和原位检测

Qiu, Y.-L., Y.Sekiguchi, H.Imachi, Y.Kamagata, I-C.Tseng, S.-S.Cheng, A.Ohashi, H.Harada: "Sporotomaculum syntrophicum sp. nov., a novel anaerobic, syntrophic benzoate-degrading bacteriumisolated from methanogenic sludge treating wastewater from terephtha

Qiu, Y.-L., Y.Sekiguchi, H.Imachi, Y.Kamagata, I-C.Tseng, S.-S.Cheng, A.Ohashi, H.Harada：“Sporotomaculum syntropicum sp. nov.，一种新型厌氧菌