Wntシグナル伝達経路におけるβ cateninの分解制御機構の解析

Wnt信号通路中控制β-catenin降解的机制分析

• 批准号: 01J08821
• 负责人: 山本 英樹
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J08821/
• 关键词: Wntシグナル伝達; Wnt; Frizzled; エンドサイトーシス; Dvl; Rho; Rhoキナーゼ; Axin; Axam; β-catenin; SUMO化; Tcf-4; GSK-3β; AKAP220

これまで、WntとFrizzled(Fz)受容体の特異性やWntがFzに結合した後に、細胞質内のDvlに至るシグナル伝達機構は詳細に明らかにされていない。細胞膜に存在する受容体はアゴニスト、あるいはアンタゴニズトと結合するとエンドサイトーシスが起こり、下流にシグナルを伝達する場合や逆に脱感作を誘導することが報告されている。そこで、本研究では、Wnt蛋白質の精製法を確立し、WntとFz受容体の特異性やWntと受容体のエンドサイトーシスの分子機構を明らかにして、Wntの性状やWntシグナル伝達の活性制御を解明することを目的としている。今年度に得られた知見は下記のとおりである。1)マウス繊維芽細胞株L細胞にWnt-3aを過剰発現させたメディウムからBlue sepharose、ゲルろ過カラム(Superdex200)、heparin sepharoseを用いて、Wnt-3aを精製した。Wntの受容体であるFzのうち、Fz5やFz6、Fz8の細胞外ドメインをGST融合蛋白質として調製し、Wnt-3aとの結合を解析した結果、いずれのFzもWnt-3aと直接結合した。2)ヒト胎児腎臓細胞株293細胞において、Fz8に対するWnt-3aの作用を解析した結果、Fz8はWnt-3a刺激後1時間まではエンドサイトーシスによって細胞膜から細胞質に移行したが、2〜3時間後にかけてリサイクルされて細胞膜に移行することを見出した。また、クラスリンを重合させることにより、エンドサイトーシスを抑制するダンシルカダベリンを細胞に作用させるとWnt-3a依存性のFz8のエンドサイトーシスやβ-カテニンの蓄積が抑制された。このことから、エンドサイトーシスによってWntシグナル伝達が制御されることが示唆された。3)ラット副腎髄質由来褐色細胞株PC12細胞において、精製したWnt-3a蛋白質はDvlを介してRhoやRhoキナーゼを活性化することにより、神経成長因子依存性の神経突起の伸長を抑制した。これらの知見は、Wnt-3aの性状とエンドサイトーシスによるWntシグナル伝達の制御機構の一端を明らかにしたものである。

こ れ ま で, Wnt と Frizzled (Fz) by the capacity of body の specificity や Wnt が Fz に combining し た に, cytoplasm after の Dvl に to る シ グ ナ ル 伝 detailed に Ming da institutions は ら か に さ れ て い な い. Membrane に exist す る by let body は ア ゴ ニ ス ト, あ る い は ア ン タ ゴ ニ ズ ト と combining す る と エ ン ド サ イ ト ー シ ス が up こ り, obscene に シ グ ナ ル を 伝 da す る occasions や inverse に off feeling as を induced す る こ と が report さ れ て い る. そ こ で, this study で は, Wnt proteins の refined を established し, Wnt と Fz by let body の specificity や Wnt と by let body の エ ン ド サ イ ト ー シ ス の molecular institutions を Ming ら か に し て, Wnt の traits や Wnt シ グ ナ ル 伝 da の active suppression を interpret す る こ と を purpose と し て い る. This year, に of the られた insights and opinions are recorded below: とお とお である. 1) マ ウ ス 繊 に d bud cell lines L cells Wnt - 3 - a を before turning 発 now さ せ た メ デ ィ ウ ム か ら Blue sepharose, ゲ ル ろ too カ ラ ム (Superdex200), heparin sepharose を with い て, Wnt - 3 a を refined し た. Wnt の is let body で あ る Fz の う ち, Fz5 や Fz6, Fz8 の extracellular ド メ イ ン を GST fusion protein と し て modulation し, Wnt - 3 - a と の combining analytical し を た results, い ず れ の Fz も Wnt - 3 - a と directly combined し た. 2) ヒ ト tire a routine where renal cell lines 293 cells に お い て, Fz8 に す seaborne る Wnt - 3 - a role の を parsing し た results, Fz8 は Wnt - 3 1 time after a stimulus ま で は エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ っ て membrane か ら cytoplasm に transitional し た が, after 2 ~ 3 time に か け て リ サ イ ク ル さ れ て membrane に transitional す る こ と Youdaoplaceholder0 see た. ま た, ク ラ ス リ ン を overlap さ せ る こ と に よ り, エ ン ド サ イ ト ー シ ス を inhibit す る ダ ン シ ル カ ダ ベ リ ン を cells に さ せ る と Wnt - 3 - a dependency の Fz8 の エ ン ド サ イ ト ー シ ス や beta カ テ ニ ン の accumulation が inhibit さ れ た. こ の こ と か ら, エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ っ て Wnt シ グ ナ ル 伝 da が suppression さ れ る こ と が in stopping さ れ た. 3) ラ ッ ト adrenal mass marrow origin brown cell line PC12 cells に お い て, refined し た Wnt - 3 a protein は Dvl を interface し て Rho や Rho キ ナ ー ゼ を activeness す る こ と に よ り, god 経 growth factor dependence の 経 protuberant の elongation を inhibit し た. こ れ ら の knowledge は, Wnt - 3 a の traits と エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ る Wnt シ グ ナ ル 伝 to の system royal institution の end を Ming ら か に し た も の で あ る.

项目成果

山本, 英樹: "Wntシグナル伝達の制御機構と発癌との関連"中山書店. 9 (2002)

Yamamoto，Hideki：“Wnt信号传导的控制机制与癌发生之间的关系”中山书店9（2002）。

Yamamoto, H.: "Sumoylation is involved in β-catenin-dependent activation of Tcf-4"EMBO J.. (in press).

Yamamoto, H.：“Sumoylation 参与 Tcf-4 的 β-catenin 依赖性激活”EMBO J..（出版中）。

Kadoya, T.: "Desumoylation activity of Axam, a novel Axin-binding protein, is involved in downregulation of β-catenin"Mol. Cell. Biol.. 22・11. 3803-3819 (2002)

Kadoya, T.：“Axam（一种新型 Axin 结合蛋白）的去苏酰化活性参与了 β-catenin 的下调”Mol Cell. 22·11 (2002)。

Kishida, S.: "Wnt-3a and Dvl retract neurite outgrowth by activating Rho-associated kinase"Mol.Cell.Biol.. in press.

Kishida, S.：“Wnt-3a 和 Dvl 通过激活 Rho 相关激酶来收缩神经突生长”Mol.Cell.Biol.. 正在出版。

Tanji, C.: "A-kinase anchoring protein AKAP22O binds to glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and mediates protein kinase A-dependent inhibition of GSK-3β"J. Biol. Chem.. 277・40. 36955-36961 (2002)

Tanji, C.：“A 激酶锚定蛋白 AKAP22O 与糖原合酶激酶 3β (GSK-3β) 结合并介导 GSK-3β 的蛋白激酶 A 依赖性抑制”J. Biol. 277・40-。 36961 (2002)