ヘテロダイマー構築による水溶性PQQグルコース脱水素酵素の反応機構の解明

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本年度の研究として以下の研究を遂行した。それぞれのサブユニットに異なる変異が導入された変異ヘテロダイマーの作製と特性検討昨年度までに最適化を行なったヘテロダイマーの作製方法を利用し、基質結合に関与する残基、Asp167をGluに置換することにより基質特異性が改良された変異酵素Asp167Gluを一つのサブユニットとして固定し、様々な変異酵素のサブユニットとのヘテロダイマーの構築を行なった。基質特異性を狭める変異が一方のサブユニットに導入されたヘテロダイマーの特性検討の結果、同変異が導入されたホモダイマーでみられるグルコース選択性は観察されず、逆に親変異酵素のホモダイマーよりも基質特異性が広がっていた。このことから基質特異性を狭めるこの変異の効果は両方のサブユニットの同じ残基に変異が導入されることで初めて発揮されうるものであるということが示唆された。そこでこの示唆に基づき、双方のサブユニットにAsp167Gluの変異が導入され、さらに一方に異なる変異が導入されたサブユニットからなるヘテロダイマーを作製し特性検討を行なった。その結果、Asp167Gluホモダイマーでみられた優れた基質特異性が示された。これらの結果よりPQQGDH-Bの活性部位はダイマー化により完成するということが提唱できる。これは作製したヘテロダイマーすべてが酵素活性を示すこと、さらに不活性型のサブユニットとのヘテロダイマーが酵素活性を示すことから。また、サブユニットの一方に基質特異性を狭める変異を導入しても予想される基質特異性が発揮されなかったことから、本酵素の基質認識を支配する基質結合ポケットの構造は、それぞれのサブユニット単独の三次構造により決定されるのではなく、両サブユニットの相互作用の結果構成されるものと推察された。