スフィンゴ脂質シグナリング伝達系を制御する中性セラミダーゼの分子生物学的研究

控制鞘脂信号转导系统的中性神经酰胺酶的分子生物学研究

• 批准号: 01J10052
• 负责人: 谷 元洋
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J10052/
• 关键词: セラミダーゼ; セラミド; スフィンゴシン

既にクローン化に成功しているラット中性セラミダーゼの細胞内局在規定シグナルの同定を行った。中性セラミダーゼをHEK293細胞に過剰発現させると、形質膜表層に存在するのみならず、細胞外に分泌された。形質膜上におけるトポロジーを解析した結果、本酵素は触媒部位を細胞外に向けたII型の膜貫通型糖タンパク質として存在することが判明した。本酵素はN末端の膜貫通領域の下流にO型糖鎖が密集して付加したセリン、スレオニン豊富な繰り返し構造(mucin box)を持つことが確認された。Mucin boxの欠損変異体は、形質膜表層に分布できず大部分は細胞外に分泌された。さらに、mucin boxに存在するO型糖鎖付加部位に変異を導入した酵素でも、同様に形質膜表層分布の減少と細胞外分泌の増大が確認された。また可溶性タンパク質である緑色蛍光タンパク質(GFP)に中性セラミダーゼのmucin boxと膜貫通領域を付加すると形質膜上に発現できるようになることを発見した。以上の結果は、mucin boxにおけるO型糖鎖付加が、タンパク質をII型の膜タンパク質として形質膜上に発現させるのに非常に重要であることを示している(J. Biol. Chem. In press)。興味深いことにmucin boxは脊椎動物の中性セラミダーゼにおいてのみ確認され、バクテリアやショウジョウバエなどの無脊椎動物では確認されなかった。緑膿菌及びショウジョウバエの中性セラミダーゼは、すべて細胞外に放出される分泌型タンパク質である(J. Biol. Chem., 273, 14368-14373, 1998 ; J. Biochem., 132, 229-236, 2002).おそらくmucin boxは中性セラミダーゼをII型の膜タンパク質として発現させるために進化の過程において獲得された構造であると考えられる。

Both に ク ロ ー ン change に successful し て い る ラ ッ ト neutral セ ラ ミ ダ ー ゼ の bureau in the cell in the specified シ グ ナ ル の with fixed line を っ た. Neutral セ ラ ミ ダ ー ゼ を に HEK293 cells before turning 発 now さ せ る と, plasma membrane surface に exist す る の み な ら ず and secretion of extracellular に さ れ た. Shape on the plasma membrane に お け る ト ポ ロ ジ ー を parsing し は た results, the enzyme catalytic site を extracellular に to け た II の transmembrane type sugar タ ン パ ク qualitative と し て exist す る こ と が.at し た. This enzyme は N terminal の transmembrane domain の obscene に O sugar lock が intensive し て plus し た セ リ ン, ス レ オ ニ ン aboundant な Qiao り return し structure (mucin box) を hold つ こ と が confirm さ れ た. The underdamaged variant of Mucin box is に distributed on the surface layer of the plasmoplasmic membrane で ず ず most of the <s:1> extracellular に secreted された. さ ら に, mucin box に す に る O sugar plus lock parts - different を import し た enzyme で も, with others in に shape distribution of plasma membrane surface の exocrine と cells の raised large が confirm さ れ た. Soluble タ ま た ン パ ク qualitative で あ る 蛍 green light タ ン パ ク mass (GFP) に neutral セ ラ ミ ダ ー ゼ の mucin box と transmembrane domain を plus す る と shape on the plasma membrane に 発 now で き る よ う に な る こ と を 発 see し た. Above の results は, mucin box に お け る O lock pay plus が sugar, タ ン パ ク qualitative を II の membrane タ ン パ ク qualitative と し て shape on the plasma membrane に 発 now さ せ る の に very important で に あ る こ と を shown し て い る j. Biol. Chem. (In press). Fun deep い こ と に mucin box は vertebrate の neutral セ ラ ミ ダ ー ゼ に お い て の み confirm さ れ, バ ク テ リ ア や シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ な ど の invertebrates で は confirm さ れ な か っ た. Pseudomonas bacteria and び シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ の neutral セ ラ ミ ダ ー ゼ は, す べ て extracellular に release さ れ る secretory type タ ン パ ク qualitative で あ る (j. Biol. Chem., 273, 14368-14373, 1998; J. Biochem., 132, 229-236, 2002). お そ ら く mucin box は neutral セ ラ ミ ダ ー ゼ を II の membrane タ ン パ ク qualitative と し て 発 now さ せ る た め に の evolution process に お い て get さ れ た tectonic で あ る と exam え ら れ る.

项目成果

Tani, M., Iida, H., Ito, M.: "O-Glycosylation of Mucin-like Domain Retains the Neutral Ceramidase on the Plasma Membranes as a Type II Integral Membrane Protein"J. Biol. Chem.. 278(In press). M207932200 (2003)

Tani, M.、Iida, H.、Ito, M.：“粘蛋白样结构域的 O-糖基化将中性神经酰胺酶保留在质膜上作为 II 型整合膜蛋白”J。

Yoshimura, Y., Okino, N., Tani, M., Ito, M.: "Molecular Cloning and Characterization of a Secretory Neutral Ceramidase of Drosophila melanogaster"J. Biochem.. 132. 229-236 (2002)

Yoshimura，Y.，Okino，N.，Tani，M.，Ito，M.：“果蝇分泌中性神经酰胺酶的分子克隆和表征”J。

伊東, 沖野, 谷, 光武, 森: "中世セラミダーゼの分子進化"蛋白質 核酸 酵素. 47. 455-462 (2002)

Ito、Okino、Tani、Mitsutake、Mori：“中世纪神经酰胺酶的分子进化”蛋白质核酸酶 47. 455-462 (2002)。