Identification and Conversion of Molecular Recognition Elements in Yeast Tyrosine tRNA

酵母酪氨酸 tRNA 中分子识别元件的鉴定和转化

基本信息

  • 批准号:
    12680632
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.7万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    2000
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2000 至 2001
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

(1) When yeast tyrosine tRNA was used in a cell-free protein-synthesizing system derived from E. coli, it was shown to be charged slightly with lysine by E. coli lysyl-tRNA synthetase (LysRS). Therefore, the primary target of this project was set to find out a way to protect the tRNA from mis-acylation by E. coli LysRS.(2) Several variants of yeast tyrosine tRNA, which have potentially negative identity elements against E. coli LysRS, were synthesized by our new method using transcription with T7 RNA polymerase and processing with RNase P. Aminoacylation activities of these tRNA variants were measured with yeast tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS) for normal tyrosine acceptance and E. coli LysRS for mis-acylation with lysine.(3) A variant tRNA, in which 3 A-U base pairs in the anticodon stem were replaced with 3 G-C base pairs, was shown to be drastically reduced in the mis-acylation, while keeping the original tyrosine-accepting ability. Thus these variations are proved to be actually part of the negative identity elements against E. coli LysRS.(4) Conversion of the amino acid specificity of yeast TyrRS was attempted by using genetic engineering and a substantial progress was achieved.(5) An unnatural (non-Watson-Crick type) base pair was developed by inserting one base (2-amino-6-(2-thienyl)purine) in the anticodon of yeast tyrosine tRNA and the other one (pyridin-2-one) in the transcribed ras mRNA.
(1)酵母酪氨酸tRNA用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统时,被大肠杆菌赖氨酰-tRNA合成酶(LysRS)轻微带入赖氨酸。因此,本项目的主要目标是寻找一种保护tRNA免受大肠杆菌LysRS错误酰化的方法。(2)利用我们的新方法,利用T7 RNA聚合酶转录和RNaseP处理,合成了几种对E.coliLysRS具有潜在阴性同一性元件的酵母酪氨酸tRNA变体。用酵母酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)检测这些tRNA变体的氨酰化活性,用酵母Tyrosyl-tRNA合成酶(TyrRS)检测这些tRNA变体的氨酰化活性。(3)用3个A-U碱基对替换反密码子茎中的3个A-U碱基对,在保持原有酪氨酸接受能力的同时,错酰化能力大大降低。利用基因工程技术对酵母TyrRS的氨基酸特异性进行了转化,并取得了实质性进展。(5)通过在酵母酪氨酸tRNA的反义密码子中插入一个碱基(2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤)和在转录后的ras基因中插入一个碱基(吡啶-2-1),构建了一个非天然(非Watson-Crick类型)碱基对。

项目成果

期刊论文数量(7)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
S.Ohno, 他: "Changing the Amino Acid Specificity of Yeast Tyrosyl-tRNA Synthetase by Genetic Engineering"J. Biochem.. 130. 417-423 (2001)
S. Ohno 等人:“通过基因工程改变酵母酪氨酰-tRNA 合成酶的氨基酸特异性” J. Biochem.. 130. 417-423 (2001)
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
I.Hirao, 他: "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins"Nature Biotechnology. 20. 177-182 (2002)
I. Hirao 等人:“用于将氨基酸类似物掺入蛋白质中的非天然碱基对”《自然生物技术》20. 177-182 (2002)。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
I. Hirao et al.: "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins"Nature Biotechnology. 20. 177-182 (2002)
I. Hirao 等人:“用于将氨基酸类似物掺入蛋白质中的非天然碱基对”《自然生物技术》。
  • DOI:
  • 发表时间:
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
S. Ohno 他: "Changing the Amino Acid Specificity of Yeast Tyrosyl-tRNA Synthetase by Genetic Engineering"J. Biochem... 130. 417-423 (2001)
S. Ohno 等人:“通过基因工程改变酵母酪氨酰-tRNA 合成酶的氨基酸特异性”J. Biochem... 130. 417-423 (2001)
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  • 作者:
  • 通讯作者:
S. Ohno et al.: "Changing the Amino Acid Specificity of Yeast Tyrosyl-tRNA Synthetase by Genetic Engineering"J. Biochem.. 130. 417-423 (2001)
S. Ohno 等人:“通过基因工程改变酵母酪氨酰-tRNA 合成酶的氨基酸特异性”J。
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