Site-selective introduction of unnatural amino acid into proteins and its use for analyses of structure-function relationship of proteins.

将非天然氨基酸位点选择性引入蛋白质及其用于分析蛋白质结构功能关系的用途。

基本信息

  • 批准号:
    16310148
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 9.41万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
  • 财政年份:
    2004
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2004 至 2006
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

1. E. coli lysyl-tRNA synthetase was found to have a weak activity to aminoacylate yeast amber suppressor tRNA^<Tyr> (CUA) with L-lysine. Since our protein-synthesizing system for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins is based on the use of yeast suppressor tRNA^<Tyr>/ tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS) pair as the "carrier" of unusual amino acid, this misacylation must be repressed as low as possible. We have succeeded in effectively repressing the misacylation by changing several nucleotides in this tRNA by genetic engineering.2. Yeast mitochondrial tRNA^<Tyr> was shown to be possibly used as an Opal-suppressor and a mutant (F38A) of yeast mitochondrial tryptophanyl-tRNA synthetase having an altered amino acid specificity was created by genetic engineering.3. An efficient method for site-selective modification of proteins using an unnatural amino acid, 3-azido-tyrosine has been developed. Using rat calmodulin as a model protein, we prepared several unnatural calmodulin molecules, each carrying an azido-tyrosine at predetermined positions. Post-translational modification of these proteins with a conjugate compound of triarylphosphine and biotin produced site-selectively biotinylated calmodulin molecules. This method is intrinsically versatile in that it should be easily applicable to introducing any other desirable compounds (e.g. probes and cross-linkers) into selected sites of proteins as far as appropriate derivative compounds of triarylphosphine could be chemically synthesized.4. As an important supporting technique for X-ray crystallographic analyses (SAD method), we have developed an effective method for incorporating 3-iodo-tyrosine into site-selective positions in a target protein. We have also determined the crystal structure of yeast TyrRS complexed with a Tyr-AMP analogue and the native tRNA^<Tyr> at 2.4 Å resolution.
1. E.发现大肠杆菌赖氨酰tRNA合成酶对酵母琥珀抑制基因tRNA^<Tyr>(CUA)的L-赖氨酸氨酰化活性较弱。由于我们的蛋白质合成系统用于将非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质中,是基于使用酵母抑制剂tRNA β<Tyr>/酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)对作为不寻常氨基酸的“载体”,因此必须尽可能低地抑制这种错酰化。我们已经成功地通过基因工程改变该tRNA中的几个核苷酸来有效地抑制错酰化.酵母线粒体tRNA α<Tyr>可能被用作Opal抑制剂,并且通过基因工程产生了具有改变的氨基酸特异性的酵母线粒体tRNA合成酶的突变体(F38 A)。利用非天然氨基酸3-叠氮基-酪氨酸对蛋白质进行位点选择性修饰的有效方法已经发展起来。使用大鼠钙调素作为模型蛋白,我们制备了几个非天然的钙调素分子,每个分子在预定的位置携带叠氮基酪氨酸。这些蛋白质的翻译后修饰与共轭化合物的三芳基膦和生物素产生的位点选择性生物素化的钙调素分子。这种方法本质上是通用的,因为它应该容易适用于将任何其他所需的化合物(例如探针和交联剂)引入蛋白质的选定位点,只要可以化学合成三芳基膦的适当衍生物化合物。作为X射线晶体学分析(SAD法)的重要支持技术,我们开发了一种有效的方法,将3-碘-酪氨酸掺入靶蛋白的位点选择性位置。我们还确定了与Tyr-AMP类似物和天然tRNA复合的酵母TyrRS的晶体结构,<Tyr>分辨率为2.4 nm。

项目成果

期刊论文数量(11)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Site-selective post-translational modification of proteins using an unnatural amino acid, 3-azidotyrosine
  • DOI:
    10.1093/jb/mvm036
  • 发表时间:
    2007-03-01
  • 期刊:
  • 影响因子:
    2.7
  • 作者:
    Ohno, Satoshi;Matsui, Megumi;Nishikawa, Kazuya
  • 通讯作者:
    Nishikawa, Kazuya
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