アポトーシス細胞死を制御するDNAポリメラーゼζの細胞生存因子としての機能解析

DNA 聚合酶 z 作为控制细胞凋亡的细胞存活因子的功能分析

基本信息

批准号：
13043048
负责人：
梶原景正
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tokai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

多細胞真核生物に特徴的なアポトーシス細胞死におけるDNAポリメラーゼζ(polζ)の役割を、その触媒サブユニットをコードするSez4遺伝子の変異マウスを用いて解析した。(1)アルキル化剤・抗癌剤などによるDNA損傷に対し、polζの関わるTLS活性をSez4抗体を用いて組織化学的に検討した。Sez4蛋白質は、アルキル化剤投与後6-24時間で核内にスポット状の陽性シグナルとして認められ、PCNAや取り込まれたBrdUの局在と一致していた。(2)Sez4トランスジェニックマウス(Sez4[tg/tg])由来の線維芽細胞は、野生型およびヘテロ型Sez4ノックアウトの細胞と比較してアルキル化剤によるDNA損傷に対し、生存効率が約2倍に上昇したが、BrdU取り込みを指標としたS期の割合はtg細胞と野生型細胞では変化なかった。以上のことから、DNA損傷をもったSez4[tg/tg]細胞がM期の進行が可能となり細胞死を回避できたが、G1期チェックポイントにより細胞周期を停止していることが示唆される。またSez4ノックアウトで認められる細胞死はp53非依存性であるが、Sez4[tg/tg]マウスにはp73欠失マウスで認められる低成長・水頭症が認められた。従って、polζのTLS活性とp73活性との相互作用によりDNA損傷をもった細胞の生存が決定され、正常な形態形成が営まれると考えられる。(3)Sez4 mRNAに相補的な2重鎖RNAを線維芽細胞へ導入し、DNA損傷に対する感受性が上昇したが、現時点ではマウス組織への導入による形態的変化は認められていない。(4)既に作製したヘテロ型Sez4ノックアウトES細胞に、Cre-loxPシステムを用いたターゲティングベクターを導入し、クローニングしている段階である。

在编码其催化亚基的SEZ4基因中，使用突变小鼠分析了DNA聚合酶ζ（POLζ）在多细胞真核生物的凋亡细胞死亡特征中的作用。（1）响应于烷基化剂，抗癌剂等引起的DNA损伤，使用SEZ4抗体研究了与POLζ相关的TLS活性。在给药烷基化剂后6-24小时，在细胞核中发现了SEZ4蛋白作为斑点样阳性信号，与PCNA的定位和掺入BRDU一致。 (2) Fibroblasts derived from Sez4 transgenic mice (Sez4[tg/tg]) increased survival efficiency by about twice as high as DNA damage caused by alkylating agents compared to wild-type and hetero-type Sez4 knockout cells, but the S-phase proportion, using BrdU uptake, was not changed in tg cells and wild-type cells.以上表明DNA受损的SEZ4 [TG/TG]细胞能够在M期进展并避免细胞死亡，但是G1相检查点会阻止细胞周期。此外，在SEZ4基因敲除中观察到的细胞死亡是p53独立的，但是SEZ4 [TG/TG]小鼠在p73缺陷小鼠中观察到了低生长和脑积水。因此，POLζ的TLS活性与p73活性之间的相互作用决定了DNA损害细胞的存活，从而导致正常的形态发生。（3）将与SEZ4 mRNA互补的双链RNA引入成纤维细胞，增加了对DNA损伤的敏感性，但是由于此时引入小鼠组织，未观察到形态学变化。（4）使用CRE-LoxP系统的靶向载体被引入先前制备的异型SEZ4基因敲除ES细胞中，并被克隆。