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転写後ジーンサイレンシング・PTGSによるウイルスRNA複製制御の分子機構

转录后基因沉默/PTGS控制病毒RNA复制的分子机制

基本信息

批准号：
13226010
负责人：
白子幸男
金额：
--
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、プラス鎖RNAウイルスの代表例であるアルファウイルス属のサギヤマウイルス(SAGV)とRNA干渉経路の存在が実験的に証明されているショウジョウバエ未熟胚由来S2細胞を用い、アルファウイルス感染S2細胞内での転写後ジーンサイレンシング・PTGS回避機構を解明することを目的として行った。今年度の研究成果の概要は以下の通りである。SAGVをS2細胞に接種し25℃で培養し、BHK21細胞を用いてウイルス増殖を解析した。その結果、培養開始12時間後にタイターの上昇が検出され、48時間後に10e+8pfu/ml近くまで達した。SAGVの構造タンパク質遺伝子をGFP遺伝子と置き換えたレプリコンRNAと非増殖型ヘルパーRNAから構成されたGFP発現性疑似感染性粒子をS2細胞に接種し25℃で培養した結果、培養開始6時間後には蛍光の発色が観察された。SAGV感染S2細胞は細胞変性を示さなかった。そこで、SAGV感染S2細胞を5日毎に4倍希釈ナ継代した。15回継代後の培地中のウイルスをBHK21細胞でプラークアッセイしたところ、10e+5pfu/ml程度で小型、微小型、および極大型プラークを形成する3種類の変異型ウイルスが、さらに45回継代したところ、小型と微小型の中間型のプラークを形成する変異型ウイルスが検出さ黷ス。これらの変異型ウイルスを限界希釈法によりBHK21細胞を用いてクローニングした。変異型ウイルスのゲノムを野生型ウイルスと比較したところ、nsP2を除く3種類の非構造タンパク質およびE1/E2膜タンパク質に複数のアミノ酸置換が認められ、1種類の変異型ウイルスからは3´末端非翻訳領域の欠失が認められた。今後、これらの変異がプラーク表現型に与える影響を調査するとともに、ウイルスゲノム上のRNAi抑制因子の特定を進める必要がある。

This study demonstrated the existence of SAGV and RNA stem pathway in S2 cells, which was a representative example of SAGV and RNA stem pathway. The purpose of this study was to clarify the mechanism of PTGS avoidance. This year's research results are summarized below. SAGV S2 cells were inoculated and cultured at 25℃, and BHK21 cells were analyzed for cell proliferation. The results were as follows: 12 hours after the start of the culture, the rise of the protein was detected, 48 hours after the start of the culture, 10e+8pfu/ml was detected. SAGV's structural protein, GFP gene, RNA, non-genomic protein, RNA, GFP gene, suspected infectious particles, S2 cells, inoculated at 25℃, cultured at 25℃, and examined by light 6 hours after culture. SAGV infection of S2 cells is a sign of cell differentiation. S2 cells infected by SAGV were 4 times more likely to be infected every 5 days. After 15 generations, BHK21 cells were cultured to form three types of heterotypes: small, micro, and extremely large at levels of 10e +5pfu/ml, 45 generations, and 45 generations. BHK21 cells were used in the study. In addition, there are three types of non-structural and E1/E2 membrane types, and three types of acid substitutions. In the future, it is necessary to investigate the effects of different RNAi phenotypes on RNAi inhibitors.