植物におけるPTGS反応系の解析

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1.トマトモザイクウイルス(ToMV)の弱毒株の解析から,野生型複製酵素が転写後型ジーンサイレンシング(PTGS)のサプレッサーであることを予想していたが,アグロインフィルトレーションアッセイによりこれを証明した.また,弱毒株に見られた変異は,複製酵素の示すサプレッサー活性そのものを完全に失活させるものではなく,感染細胞内での複製酵素の安定性や局在性に変化をもたらすものであることが示唆された.2.サプレッサーの作用点について,種々の組み換えウイルスを調製して解析した.その結果,ToMVのサプレッサーは,サイレンシングに伴い生じる21〜25塩基のsiRNA合成以降のステップで働くこと,既に形成されている配列特異的なRNA分解酵素複合体(RISC)の活性は阻害しないことが明らかとなった.これから,ToMVのサプレッサーは配列特異的なRNA分解酵素複合体の新規形成を阻害すると考えられた.3.タバコ培養細胞から,試験管内でのタンパク合成活性があり,非特異的なRNA分解酵素活性が極めて低い分画を調製する方法を確立した.この画分に含まれる種々の酵素活性を解析した結果,2本鎖RNAを切断するDicerの活性を認めた.この活性により長い2本鎖RNAは約21-23塩基と,約25塩基の2種のsiRNAに切断された.このパターンは,PTGSが起こっているタバコで認められるsiRNAのパターンと一致している.この系を用いることにより,サプレッサーの作用機作を試験管内で証明することが可能と考えられる.4.ToMVの感染葉におけるsiRNA生成の解析から,奇形を伴う病徴発現においては,サプレッサーがmiRNA経路の阻害をしていることが予想された.