植物におけるPTGS反応系の解析

植物PTGS反应体系分析

• 批准号: 14035228
• 负责人: 飯 哲夫
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14035228/
• 关键词: 転写後ジーンサイレンシング; RNAサイレンシング; 植物ウイルス; 複製酵素; PTGSサプレッサー

1.トマトモザイクウイルス(ToMV)の弱毒株の解析から,野生型複製酵素が転写後型ジーンサイレンシング(PTGS)のサプレッサーであることを予想していたが,アグロインフィルトレーションアッセイによりこれを証明した.また,弱毒株に見られた変異は,複製酵素の示すサプレッサー活性そのものを完全に失活させるものではなく,感染細胞内での複製酵素の安定性や局在性に変化をもたらすものであることが示唆された.2.サプレッサーの作用点について,種々の組み換えウイルスを調製して解析した.その結果,ToMVのサプレッサーは,サイレンシングに伴い生じる21〜25塩基のsiRNA合成以降のステップで働くこと,既に形成されている配列特異的なRNA分解酵素複合体(RISC)の活性は阻害しないことが明らかとなった.これから,ToMVのサプレッサーは配列特異的なRNA分解酵素複合体の新規形成を阻害すると考えられた.3.タバコ培養細胞から,試験管内でのタンパク合成活性があり,非特異的なRNA分解酵素活性が極めて低い分画を調製する方法を確立した.この画分に含まれる種々の酵素活性を解析した結果,2本鎖RNAを切断するDicerの活性を認めた.この活性により長い2本鎖RNAは約21-23塩基と,約25塩基の2種のsiRNAに切断された.このパターンは,PTGSが起こっているタバコで認められるsiRNAのパターンと一致している.この系を用いることにより,サプレッサーの作用機作を試験管内で証明することが可能と考えられる.4.ToMVの感染葉におけるsiRNA生成の解析から,奇形を伴う病徴発現においては,サプレッサーがmiRNA経路の阻害をしていることが予想された.

1. The analysis of attenuated strains of ToMV, wild type replicase and post-transcription-type virus (PTGS), and the identification of these strains. In addition, attenuated strains are found to be different from each other, and the expression of replicase activity is completely inactivated. However, the stability of replicase in infected cells is partially changed. 2. The site of action of replicase activity is detected, and the composition of replicase activity is modulated. As a result,ToMV's siRNA synthesis was inhibited by the formation of a sequence-specific RNA-decomposing enzyme complex (RISC). 3. To establish a method for modulating the activity of non-specific RNAase in vitro by inhibiting the formation of novel RNAase complexes in vitro. The enzyme activity analysis results of these assays, including the presence of the enzyme, showed that the activity of Dicer was identified by RNA cleavage. The activity of these two siRNAs is about 21-23 bp, and about 25 bp. PTGS is the most common form of siRNA. 4. Analysis of siRNA production in infected leaves of ToMV. Strange patterns associated with the development of disease characteristics.

项目成果

Hagiwara Y. et al.: "Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication"EMBO J.. 22. 344-353 (2003)

Hagiwara Y.等：“与烟草花叶病毒RNA复制相关的宿主和病毒蛋白的亚细胞定位”EMBO J.. 22. 344-353 (2003)

Yamanaka et al.: "Complete inhibition of tobamovirus multiplication by simultaneous mutations in two homologous genes"J. Virol.. 76. 2491-2497 (2002)

Yamanaka 等人：“通过两个同源基因的同时突变完全抑制烟草病毒的增殖”J.