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HACCPにおける微生物管理を目的とした有害微生物の迅速・簡便な検出法の開発

开发一种快速、简单的有害微生物检测方法，用于 HACCP 微生物控制

基本信息

批准号：
13771421
负责人：
山口進康
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

食中毒を未然に防ぎ,被害を最小限にとどめるには,原因微生物の検出およびその環境中における動態の解明が欠かせない.そこで,活性を持つ特定種の微生物を迅速・簡便に検出可能な系を確立するために,前年度は細胞の呼吸能を評価できる蛍光染色剤CTC(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride)およびFITC標識抗体を用いた二重染色(蛍光抗体-CTC二重染色)法の検討を行った.本年度は前年度の研究成果をふまえ,抗体の作成が難しい危害微生物を検出するために,CTC-FISH二重染色法を検討した.FISH法はrRNA上の属種特異的な配列を対象として,蛍光標識プローブを用いて微生物細胞内でハイブリダイゼーションを行うものである.(1)CTC-FISHでは試料中の微生物の呼吸の有無を,菌体内に生じる蛍光性結晶体(CTCフォルマザン)により確認する.しかしながら,通常のFISHの操作ではCTCフォルマザンが溶出するという問題があった.そこでミネラルウォーター中に添加した大腸菌を用いて,CTC-FISH法の条件検討を行った.その結果,脱水操作およびハイプリダイゼーション用バッファーの組成を最適化することにより,菌体内のCTCフォルマザンの減少を抑えながらも大腸菌を特異的に検出することができるようになった.(2)ミルク中の生きている大腸菌を,タンパク質分解酵素および界面活性剤による前処理を含めて,蛍光顕微鏡下で5時間以内に簡便かつ特異的に定量できるようにした.(3)本手法は,用いる遺伝子プローブを変えることにより,様々な種類の生きている危害微生物の検出が可能である.また別に検討している溶液中FISH法を併用することにより,フローサイトメトリーにも応用可能であると考えられる.

Food poisoning prevention, the minimum limit of harm, the cause of microbial detection and the environment, the dynamics of the solution. In this paper, the activity of specific species of microorganisms can be rapidly and easily detected. In the past year, the respiratory energy of cells was evaluated. The CTC(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride) staining method and FITC staining method were discussed. This year's research results show that the production of antibodies is difficult to detect. CTC-FISH double staining method is used to detect species specific alignment of rRNA. (1)CTC-FISH confirms the presence or absence of respiration of microorganisms in the sample and the existence of fluorescent crystals (CTC) in the bacteria. In general, FISH operation is not a problem for CTC dissolution. The conditions of CTC-FISH method were discussed by adding Escherichia coli to the sample. As a result, the dehydration operation was optimized for the composition of the bacteria, and the reduction of CTC in the bacteria was inhibited. (2)Coliform bacteria are produced in the medium, and the enzyme and surfactant are used for pretreatment. Under the microscope, it is easy to quantify the specific bacteria within 5 hours. (3)This method is to use the Iru gene to change the skin, so it is possible to detect harmful microorganisms of different types. The method of FISH in solution can be used in different ways.