HACCPにおける微生物管理を目的とした有害微生物の迅速・簡便な検出法の開発

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食中毒を未然に防ぎ,被害を最小限にとどめるには,原因微生物の検出およびその環境中における動態の解明が欠かせない.そこで,活性を持つ特定種の微生物を迅速・簡便に検出可能な系を確立するために,前年度は細胞の呼吸能を評価できる蛍光染色剤CTC(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride)およびFITC標識抗体を用いた二重染色(蛍光抗体-CTC二重染色)法の検討を行った.本年度は前年度の研究成果をふまえ,抗体の作成が難しい危害微生物を検出するために,CTC-FISH二重染色法を検討した.FISH法はrRNA上の属種特異的な配列を対象として,蛍光標識プローブを用いて微生物細胞内でハイブリダイゼーションを行うものである.(1)CTC-FISHでは試料中の微生物の呼吸の有無を,菌体内に生じる蛍光性結晶体(CTCフォルマザン)により確認する.しかしながら,通常のFISHの操作ではCTCフォルマザンが溶出するという問題があった.そこでミネラルウォーター中に添加した大腸菌を用いて,CTC-FISH法の条件検討を行った.その結果,脱水操作およびハイプリダイゼーション用バッファーの組成を最適化することにより,菌体内のCTCフォルマザンの減少を抑えながらも大腸菌を特異的に検出することができるようになった.(2)ミルク中の生きている大腸菌を,タンパク質分解酵素および界面活性剤による前処理を含めて,蛍光顕微鏡下で5時間以内に簡便かつ特異的に定量できるようにした.(3)本手法は,用いる遺伝子プローブを変えることにより,様々な種類の生きている危害微生物の検出が可能である.また別に検討している溶液中FISH法を併用することにより,フローサイトメトリーにも応用可能であると考えられる.