蛋白質工学の手法を用いた芳香環開裂酵素の改良

利用蛋白质工程技术改进芳环裂解酶

• 批准号: 13780489
• 负责人: 杉本 敬祐
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Asahikawa National College of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780489/
• 关键词: 二原子酸素添加酵素; 蛋白質工学; X線結晶学

本年度は、酵素の再活性化のための実験装置作成および再活性化実験と、酵素活性を高める目的で変異体酵素を作成した。(1)脱酸素装置の作成本酵素の活性には活性中心に二価の鉄イオンが必要である。酸素を含む大気下での実験では、この鉄イオンが容易に酸化されるために酵素活性は失われる。このため、活性能を高めることを狙ったいくつかの変異体の酵素活性を評価する場合、各酵素の鉄イオンが完全に二価の状態(活性化状態)になっている必要がある。そこで失活の原因となる酸素を酵素サンプルから取り除く装置を作成した。(2)不活性酵素の再活性化実験上記の脱酸素装置を用いて、大気下で精製したPheB酵素に対して再活性化実験を行ったところ、酵素活性が上昇した。現在、不活性化した酵素が全て再活性化できるような条件を検討しているところである。今後得られる再活性化条件を天然型および変異型PheB酵素に用いることにより、正確な酵素活性の比較を行うことが可能となる。(3)酵素活性を高めることを目的とした変異体酵素の作成PheB酵素とBphC酵素(PheB酵素と基質特性が異なる)の立体構造を比較したところ、BphC酵素の活性中心には、セリンプロテアーゼの水素リレーと類似した構造を形成していた。この水素リレーの形成は、BphC酵素の活性を高める働きをしていると考えている。一方、PheB酵素には、このような水素リレーを形成する構造を形成していない。そこで、コンピューターグラフィクス上のPheB酵素とBphC酵素の立体構造を照らし合わし、PheB酵素に水素リレーを形成できるような変異体を作成した。現在、(2)の再活性化条件を検討しだい、これら変異体酵素の酵素学的データを測定し、また同時にX線結晶構造解析を行う予定である。

This year, the reactivation of enzymes and the production of heterologous enzymes are aimed at increasing enzyme activity. (1)The activity of the enzyme in the deacidification device is necessary for the activation of the active center. The enzyme activity is lost when the acid content is high. When evaluating the activity of different enzymes, it is necessary for the iron content of each enzyme to be in a completely different state (activated state). The reason for inactivation is that the enzyme is removed and the device is made. (2)Reactivation of inactive enzymes in the presence of a deaminase device, purification of PheB enzymes under high temperature, reactivation of enzymes, enzyme activity increased Now, inactive enzymes are fully reactivated. In the future, the reactivation conditions of natural PheB enzyme and heterotype PheB enzyme will be obtained. (3)The enzyme activity is high, and the enzyme structure is similar to that of BphC. The activity of BphC enzyme is high. A side, PheB enzyme, water element, water element. The three-dimensional structure of PheB enzyme and BphC enzyme on the surface of the cell is illuminated, and the structure of PheB enzyme and BphC enzyme is formed. Now, the reactivation conditions of (2) are discussed, and the enzymatic properties of the heterologous enzymes are determined. At the same time, X-ray crystal structure analysis is performed.