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高度好熱菌を用いた進化分子工学と蛋白質工学の併用による酵素の耐熱化設計

利用高度嗜热细菌，结合进化分子工程和蛋白质工程进行酶的耐热设计

基本信息

批准号：
11780431
负责人：
玉腰雅忠
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに高度好熱菌を用いて3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を進化分子工学的に耐熱化する実験系を開発してきた。その実験系を用いて大腸菌IPMDHの耐熱化を試みたところ、S106I、S106I+G337W、S106I+A222Eなどの変異が得られていた。このような進化的手法と蛋白質工学的手法を組み合わせることによって、これらの変異の役割を以下のように調べ、蛋白質の安定化に関する知見を得た。(1)G337W変異酵素とランダム変異酵素の解析S106I+G337Wの二重変異酵素は、S106Iの単独変異酵素よりも耐熱性が高かった。また、G337W単独の変異酵素は大腸菌野生型酵素より耐熱化していたが、その程度はS106I変異が存在する場合よりも小さかった。次にG337部位の20種類全てのアミノ酸に置換した変異酵素を作製し、耐熱性を調べた。その結果、耐熱性は野生型酵素と同程度か、或いは上昇・低下した場合でも、その差はわずかだった。G337部位は分子表面のループ中にあるが、このような位置にあるグリシンは、別のアミノ酸に置換することによって耐熱化すると思われている。しかし、その様な場合でも耐熱化するとは限らず、また耐熱化する場合でもその程度は小さい場合があることがわかった。(2)A222E変異酵素の解析A222E変異酵素の耐熱性は、野生型酵素よりもやや低下したが、S106I酵素と比べてS106I+A222E変異酵素の方が耐熱性が高かった。したがって、A222E変異の耐熱化効果は、S106Iがある場合に見られることがわかった。S106、G337およびA222部位は、互いに立体構造上数十Å離れており、人為的設計は難しい。今後調べるべき新たな課題は、立体構造上離れた部位が安定性に影響を及ぼしあうメカニズムを調べることである。

This is the development of a 3-dimensional thermal stability system for evolutionary molecular engineering. The heat resistance of E. coli IPMDH was tested in different ways, such as S106I, S106I + G337W and S106I + A222E. The method of protein engineering is combined with the method of protein engineering. (1) Analysis of G337W isoenzyme and S106I + G337W isoenzyme and S106I isoenzyme. In addition, the G337W unique mutant enzyme is less heat-resistant than the E. coli wild-type enzyme, and the degree of specificity is different from that of S106I. The next 20 species of G337 are all acid replacement enzymes that regulate heat resistance. The result of heat tolerance is the same as that of wild-type enzyme, or the difference between them is the same. The G37 site is located in the middle of the molecular surface. In the case of heat resistance, the degree of heat resistance is small. (2) Analysis of A222E isoenzyme The heat resistance of A222E isoenzyme is lower than that of wild-type enzyme. The heat resistance of S106I isoenzyme is higher than that of S106I + A222E isoenzyme. A222E is different from the heat resistant effect, S106I is different from the heat resistant effect. S106, G337 and A222 are separated from each other in three-dimensional structure, and artificial design is difficult. In the future, it will be a new topic to adjust the stability of the three-dimensional structure.