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新しく同定された生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモンの発現制御機構と作用機構

新发现的促性腺激素释放抑制激素的表达控制机制和作用机制

基本信息

批准号：
02F00504
负责人：
筒井和義
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

【背景と目的】我々のグループは最近ウズラの脳から生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモン(GnIH)という新しい神経ペプチドを発見した。GnIHの作用機構を明らかにするために、GnIH受容体の同定を試みた。3',5'RACE法により同定されたGnIH受容体候補蛋白質は、アミノ酸配列が399aaであり、7つの疎水性膜貫通ドメインがあるから、G-Protein Coupled Receptorの一つと推定された。次に、この蛋白質がGnIHの受容体であることを確認するために、哺乳類細胞に一過的に強制発現した膜蛋白質を用いてLigand Binding Assayを行った。【方法】増幅精製した受容体DNAをInvitrogen社のpcDNA3.1ベクターにライゲーションし、TOP10大腸菌にトランスフォメーションした。次に、Promega社のWizard Maxiprepsでプラスミドを選択し大量作製した。リポフェクション法によりCOS-7細胞にトランスフェクションして、この蛋白質を発現させた細胞の膜画分を用いてBinding Assayを行った。【結果と考察】^<125>IでラベルしたGnIHはMock細胞(コントロールDNAをトランスフェクションしたもの)と結合しない一方で、受容体cDNAを発現させた細胞とは結合した。Specific Binding Assay及びSaturation Binding Assayの結果、この新しく同定された受容体蛋白質はGnIHと高い親和性を示し、GnIHの受容体であることが確認された。今後、下垂体に同じ受容体蛋白質が発現していることを調べるために、下垂体組織でのBinding Assayを行う予定である。

[Background and Objective] We have recently developed a new type of gonadal stimulation inhibitor (GnIH). GnIH's action mechanism is clear, and GnIH's receptor is stable. 3',5'RACE method is used to determine the GnIH receptor candidate protein, acid alignment 399aa, 7 aa, G-Protein Coupled Receptor and G-Protein Coupled Receptor. The Ligand Binding Assay was used to determine the expression of proteins in mammalian cells. [Methods] Amplitude purification of receptor DNA from Invitrogen pcDNA3.1 and TOP10 Escherichia coli In addition, Promega's Wizard Maxipreps have been selected for mass production. The Binding Assay was used to detect the protein expression in COS-7 cells. [Results]^<125>I found that GnIH Mock cells (DNA) and receptor cDNA were found in one side and in the other side. Specific Binding Assay and Saturation Binding Assay results, new identification, high affinity for GnIH receptor proteins, confirmation In the future, the same receptor protein in the pituitary gland will be detected, and the Binding Assay in the pituitary tissue will be determined.