無細胞系蛋白質発現系を利用した新しい安定同位体標識NMR技術の生体分子の構造研究への応用

利用无细胞蛋白表达系统的新型稳定同位素标记核磁共振技术在生物分子结构研究中的应用

• 批准号: 02F00728
• 负责人: 甲斐荘 正恒
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00728/
• 关键词: 無細胞蛋白質発現系; α-シヌクレイン; アミノ酸置換変異体; 安定同位体標識; カルモジュリン; SDS; α-ヘリックス; 多次元NMRスペクトル; NMR; 無細胞蛋白質発現; DHFR; ^<19>F-NMR; 残余双極子結合定数

分担マイルズは本研究室において確立している大腸菌の無細胞抽出液による蛋白質発現技術に習熟し、幾つかの新しい蛋白質の無細胞合成に成功した。分担者の興味は、球状蛋白質以外の"本来立体構造を持たない"(intrinsically unfolded)蛋白質の機能に関して向けられており、短時間で結果の得にくい対象ではあるが本人の希望でもありそれらの研究に従事させた。マイルズはパーキンソン氏病の関わる蛋白質α-synuclein、及びそのアミノ酸置換変異体2種類に関して通常の無細胞発現系を利用して発現させ、また構造解析に必要な量の同位体標識試料の精製に成功した。これらの水溶液試料のNMRスペクトルはα-synucleinは典型的なランダムコイル状態にあることを示している。しかしながら、SDSを加えた溶液中では一部にαヘリックス特有のシグナルを示した。3種類の試料に関して種々のNMRスペクトルを測定し、それらの解析を概ね終了し、配列帰属を行うことができた。構造決定に向けて測定したNOEスペクトルに関しては、時間が無くこちらからデータを送付し現在母国オーストラリアにおいて解析を行っている。α-synucleinがカルシウム結合蛋白質カルモジュリンと強く結合し複合体を形成するとの興味深い報告を元に、"複合体"のNMRスペクトルを測定したが、残念ながら文献に述べられているような複合体の形成は全く検知できなかった。その他、耐乾燥性種子中に蓄積される特有なアミノ酸配列を持つ蛋白質群LEAの無細胞系での発現にも成功した。LEAは残念ながらSDS存在下においても明確な二次構造の形成は見られなかった。期間が限られていたために、技術習得と発現に概ね終始し、肝心な構造研究への取り組みは必ずしも十分ではなかった。

Share マ イ ル ズ は our lab に お い て establish し て い る coliform の cell-free extract に よ る protein に 発 now technology acquisition し, several つ か の new し い protein の cell free synthetic に successful し た. Shared interests は の, globular proteins outside の "original three-dimensional structure を hold た な い" (intrinsically unfolded) protein の function に masato し て to け ら れ て お り, short time で results の に く い like で seaborne は あ る が my の I wish で も あ り そ れ ら の research に 従 matter さ せ た. マ イ ル ズ は パ ー キ ン ソ ン's disease の masato わ る protein alpha synuclein, and び そ の ア ミ ノ acid replacement 1-2 kinds に masato し て usually の cell free 発 department を now use し て 発 now さ せ, ま た structure の に な necessary quantity with the bit body logo sample の refined に successful し た. こ れ ら の aqueous sample の NMR ス ペ ク ト ル は alpha synuclein は typical な ラ ン ダ ム コ イ ル state に あ る こ と を shown し て い る. し か し な が ら, SDS を え た solution で は a に alpha ヘ リ ッ ク ス の unique シ グ ナ ル を shown し た. 3 kinds の sample に masato し て kind 々 の NMR ス ペ ク ト ル を し, そ れ ら の parsing を almost ね し, with the end of column 帰 を rows う こ と が で き た. Determination of structure decided to け に て し た NOE ス ペ ク ト ル に masato し て は, time が く こ ち ら か ら デ ー タ を send pay し now home オ ー ス ト ラ リ ア に お い analytical line を っ て て い る. Alpha synuclein が カ ル シ ウ ム binding protein カ ル モ ジ ュ リ ン と combines strong く し complex を form す る と の tumblers deep を yuan に い report, "complex" の NMR ス ペ ク ト ル を determination し た が, residual な が ら literature に above べ ら れ て い る よ う な complex の form は full く 検 know で き な か っ た. そ の he に accumulation, resistance to dry seeds さ れ る な unique ア ミ ノ acid with column を hold つ LEA protein group の no cell line で の 発 now に も successful し た. Under the presence of the residual ながらSDS of LEA な, the にお て て て て ながら clearly indicates the な secondary structure <s:1> formation. See られな った った った. During が limit ら れ て い た た め に, technology acquisition と 発 に now almost ね beginning し structural study of the heart, liver な へ の group take り み は will ず し も very で は な か っ た.