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無細胞系蛋白質発現系を利用した新しい安定同位体標識NMR技術の生体分子の構造研究への応用

利用无细胞蛋白表达系统的新型稳定同位素标记核磁共振技术在生物分子结构研究中的应用

基本信息

批准号：
02F00728
负责人：
甲斐荘正恒
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

分担マイルズは本研究室において確立している大腸菌の無細胞抽出液による蛋白質発現技術に習熟し、幾つかの新しい蛋白質の無細胞合成に成功した。分担者の興味は、球状蛋白質以外の"本来立体構造を持たない"(intrinsically unfolded)蛋白質の機能に関して向けられており、短時間で結果の得にくい対象ではあるが本人の希望でもありそれらの研究に従事させた。マイルズはパーキンソン氏病の関わる蛋白質α-synuclein、及びそのアミノ酸置換変異体2種類に関して通常の無細胞発現系を利用して発現させ、また構造解析に必要な量の同位体標識試料の精製に成功した。これらの水溶液試料のNMRスペクトルはα-synucleinは典型的なランダムコイル状態にあることを示している。しかしながら、SDSを加えた溶液中では一部にαヘリックス特有のシグナルを示した。3種類の試料に関して種々のNMRスペクトルを測定し、それらの解析を概ね終了し、配列帰属を行うことができた。構造決定に向けて測定したNOEスペクトルに関しては、時間が無くこちらからデータを送付し現在母国オーストラリアにおいて解析を行っている。α-synucleinがカルシウム結合蛋白質カルモジュリンと強く結合し複合体を形成するとの興味深い報告を元に、"複合体"のNMRスペクトルを測定したが、残念ながら文献に述べられているような複合体の形成は全く検知できなかった。その他、耐乾燥性種子中に蓄積される特有なアミノ酸配列を持つ蛋白質群LEAの無細胞系での発現にも成功した。LEAは残念ながらSDS存在下においても明確な二次構造の形成は見られなかった。期間が限られていたために、技術習得と発現に概ね終始し、肝心な構造研究への取り組みは必ずしも十分ではなかった。

The research team has successfully established cell-free protein production techniques for E. coli and developed new cell-free protein synthesis techniques. The function of protein is related to the change of taste, the change of original three-dimensional structure (intrinsically unfolded) of globular protein, and the change of result in short time. The protein α-synuclein and the protein α-synuclein related to the disease were successfully purified by using the cell-free development system and the necessary amount of isotope identification sample for structural analysis. The NMR spectra of the aqueous samples show the typical α-synuclein state. A part of the solution of SDS was added to the solution. 3. Sample selection, analysis, classification and analysis The structure determines the direction of the measurement, the time of the measurement, and the time of the analysis.α-synuclein binding protein complex formation and strong binding protein complex formation are reported in detail. NMR spectra of "complex" are determined. The formation of complex formation is fully known. The successful development of cell line-free protein group LEA with unique acid alignment in other, desiccation tolerant seeds LEA is a residual structure in the presence of SDS. Time limit, technology acquisition and discovery, liver and heart structure research, selection and development