枯草菌細胞抽出液中のメタボローム分析

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本年度は最終年度であり、11月までの7ヶ月余であったので、前年度行ったミクロ液体クロマトグラフィー(μ-LC)とキャピラリー電気泳動(CE)とを組み合わせた二次元分析法によるメタボローム分析法の更なる発展を試みた。前年度では代謝物中に存在すると予想される化合物のうち紫外吸収のある化合物54種の混合物を標準試料として用いて分離条件等を検討した。検出法には紫外吸光(UV)検出法を用いたが、本年度は紫外吸収のない化合物も含めて118種の混合物を標準試料として用いた。また、検出には質量分析計(MS)の使用を前提にLCおよびCEに揮発性電解質である炭酸アンモニウムを用いた。μ-LCカラムには前回のものと同じであるが長さが50cmと長く、試料負荷量の大きなものを用いた。移動相にメタノール(A)と30mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH4.0)(B)を用い、A:B=3:97から98:2へ25分での濃度勾配溶離を行い、その後10分間98:2で溶離した。流量は2μL/min、試料注入量は1μLとした。CE条件として、泳動液に100mM炭酸アンモニウム緩衝液(pH9.6)を用い、試料注入には電場増強電気的試料注入法を採用した。前回採用したダイナミックpHジャンクションよりは電場増強スタッキング法の方が試料濃縮に有効であった。CEにおける検出限界は2-183ng/mLであった。大腸菌の代謝物を試料に用いて二次元分離を行った。操作は前回報告と同じで、前回の場合よりも9種新規な代謝物の検出が可能であった。時間の関係でMS検出を用いた実験まではできなかった。