微生物が生産する新規ラクトナーゼの探索と構造・機能解析及び有用物質生産への応用

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1.Pseudomonas sp.3-1株由来(R)-δ-デカノラクトン加水分解酵素の精製δ-デカノラクトンを立体選択的に加水分解する新規ラクトン加水分解酵素(ラクトナーゼ)の探索を行った結果、δ-デカノラクトン資化性菌として自然界より分離されなPseudomonas sp.3-1株より目的酵素の精製キャラクタリゼーションを行った。本酵素は膜結合型タンパク質であったため界面活性剤Triton X=100による可溶化操作の後、(NH_4)_2SO_2分画、各種クロマトグラフィーを経て、電気泳動的に均一な標品を得た。本酵素はδ-デカノラクトンの(R)-体にのみ選択的に作用し、ほかにもδ-オクタノラクトン、δ-ヘプタノラクトンなどに対してもやはり(R)-体選択的な加水分解活性を示した。2.Agrobacterium tumefaciens由来L-パントラクトン加水分解酵素遺伝子発現系の構築パントラクトン(PL)の不斉加水分解による光学分割を目的として、A.tumefaciens由来のL-PL加水分解酵素遺伝子の大腸菌内での大量発現を試みた。常法どおり目的酵素遺伝子を発現用プラスミドベクターに組み込み、これを形質転換した大腸菌では組換え酵素は不活性な封入体として生産された。活性型組換え酵素を得るため種々の検討を行った結果、分子シャペロンチームgroES-ELとの共発現下で効率的にL-PL加水分解酵素を活性型酵素として回収することができた。本共発現株の湿菌体(5% w/v)を触媒として用いることにより、10% w/vのラセミ体PL中のL-体のみを2時間以内で定量的にL-パント酸へと変換できることを示した。