微生物が生産する新規ラクトナーゼの探索と構造・機能解析及び有用物質生産への応用

寻找微生物产生的新内酯酶、结构和功能分析以及在有用物质生产中的应用

• 批准号: 02J01729
• 负责人: 本田 孝祐
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J01729/
• 关键词: 光学分割; 加水分解酵素; 立体選択的加水分解; ラクトン; ラクトナーゼ; δ-デカノラクトン; パントラクトン

1.Pseudomonas sp.3-1株由来(R)-δ-デカノラクトン加水分解酵素の精製δ-デカノラクトンを立体選択的に加水分解する新規ラクトン加水分解酵素(ラクトナーゼ)の探索を行った結果、δ-デカノラクトン資化性菌として自然界より分離されなPseudomonas sp.3-1株より目的酵素の精製キャラクタリゼーションを行った。本酵素は膜結合型タンパク質であったため界面活性剤Triton X=100による可溶化操作の後、(NH_4)_2SO_2分画、各種クロマトグラフィーを経て、電気泳動的に均一な標品を得た。本酵素はδ-デカノラクトンの(R)-体にのみ選択的に作用し、ほかにもδ-オクタノラクトン、δ-ヘプタノラクトンなどに対してもやはり(R)-体選択的な加水分解活性を示した。2.Agrobacterium tumefaciens由来L-パントラクトン加水分解酵素遺伝子発現系の構築パントラクトン(PL)の不斉加水分解による光学分割を目的として、A.tumefaciens由来のL-PL加水分解酵素遺伝子の大腸菌内での大量発現を試みた。常法どおり目的酵素遺伝子を発現用プラスミドベクターに組み込み、これを形質転換した大腸菌では組換え酵素は不活性な封入体として生産された。活性型組換え酵素を得るため種々の検討を行った結果、分子シャペロンチームgroES-ELとの共発現下で効率的にL-PL加水分解酵素を活性型酵素として回収することができた。本共発現株の湿菌体(5% w/v)を触媒として用いることにより、10% w/vのラセミ体PL中のL-体のみを2時間以内で定量的にL-パント酸へと変換できることを示した。

1. Strain Pseudomonas sp.3-1 was isolated from nature and purified from target enzyme. After solubilization,(NH_4)_2SO_2 fractionation, various kinds of membrane binding, interfacial activity, and electrophoresis, uniform standards were obtained. This enzyme has been shown to have a catalytic activity against the (R)-selective hydrolysis of δ-and δ-proteins. 2. A.tumefaciens L-PL hydrolysis enzyme gene production system was constructed for the purpose of optical separation of L-PL hydrolysis enzyme gene from A.tumefaciens. The target enzyme gene is often used to produce the enzyme in the form of an inactive plasmid. The results of the study on the activity of the enzyme group, the molecular structure and the co-production rate of the enzyme group, the L-PL hydrolysis enzyme group and the enzyme group, are as follows: The present invention discloses a wet cell (5% w/v) catalyst, which can be used for the determination of L-body in PL within 2 hours.

项目成果

K.Honda: "Role of Acinetobacter calcoaceticus 3,4-dihydrocoumarin hydrolase in oxidative stress defence against peroxoacids"Eur.J.Biochem.. 270. 486-494

K.Honda：“醋酸钙不动杆菌 3,4-二氢香豆素水解酶在针对过氧酸的氧化应激防御中的作用”Eur.J.Biochem.. 270. 486-494

K.Honda: "Biocatalytic deprotection of a cetraxate ester by Microbacterium sp. strain 7-1W cells"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 67. 192-194

K.Honda：“微杆菌属菌株 7-1W 细胞对西曲酯的生物催化脱保护”Biosci.Biotechnol.Biochem.. 67. 192-194

K.Honda: "Biocatalytic deprotection of a cetraxate by Microbacterium sp. strain 7-1 W cells"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 67. 192-194 (2003)

K.Honda：“微杆菌菌株 7-1 W 细胞对西曲沙酯的生物催化脱保护”Biosci.Biotechnol.Biochem.. 67. 192-194 (2003)

K.Honda: "Role of Acinetobacter calcoaceticus 3,4-dihydrocoumarin hydrolase in oxidative stress defence against peroxoacids"Eur.J.Biochem.. 270. 486-494 (2003)

K.Honda：“乙酸钙不动杆菌 3,4-二氢香豆素水解酶在针对过氧酸的氧化应激防御中的作用”Eur.J.Biochem.. 270. 486-494 (2003)

本田 孝祐: "化学品の製造に有用な生体触媒の探索と開発"ケミカルエンジニヤリング. 47. 345-351

本田浩介：“用于制造化学产品的生物催化剂的探索和开发”化学工程 47. 345-351。