人工膜上に再構築したRasシグナル伝達系の1分子可視化解析

人工膜上重建Ras信号转导系统的单分子可视化分析

• 批准号: 02J05041
• 负责人: 新井 由之
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J05041/
• 关键词: Ras; 脂質二重膜; FRET; 1分子観察; エフェクター; 1分子イメージング; 偏光; 準安定状態; 蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)

低分子量Gタンパク質の一つRasは細胞の増殖や分化の促進に重要な役割を果たす、代表的なシグナル伝達タンパク質である。通常はGDPと結合した不活性型であるが、ホルモンなどの細胞外刺激により、GTPと結合した活性型へと交換される。活性型のRasはRafやRalGDSなど多様な標的タンパク質と結合することにより、様々なシグナル伝達経路に関与している。しかし、Rasがどのようにしてそれら多様な標的タンパク質を選択しているかは明らかではない。本研究は、人工膜上という、比較的生体内に近い条件で、しかし環境をコントロール系を構築することで、Rasの詳細な機能解明を目的としている。DOPCとNi-NTA-DOGSを混合して作成したliposomeを20mMCa^<2+>条件下で融合させ、電気炉で処理したスライドガラス上に脂質二重膜を形成させることに成功した。His-tagを融合させたRasタンパク質を膜上で観察することに成功した。1分子観察時においては、タンパク質は固定されていることが望ましいが、AnnexinVを加えることで、膜上のタンパク質の拡散を抑制することに成功した。さらに、非特異的結合の激しいRasの標的タンパク質を、二重膜で防ぐことにより、Rasと標的タンパク質との1対1の結合乖離の観察に成功した。また、蛍光標識したRasと蛍光性GTPアナログとのFRETを、ガラスとの相互作用にみだされることなく観察することに成功した。その結果、Rasの構造はmsec〜secの領域でゆっくりと揺らいでいることが示唆された。本研究で作成した系は、膜タンパク質の研究やシグナル伝達系の研究において、非常に有用であり、今後これらの分野において、積極的に利用される系と考えられる。

It is important to promote the proliferation and differentiation of low-molecular-weight G-cells, and is the representative one of the most important ones. Usually, it is the inactive type that binds to GDP, the extracellular stimulation of ホルモンなどの, and the active type that binds to GTP and exchanges it. Active type of Ras and Raf and Ral GDS, many of them, and the standard substanceと合することにより、様々なシグナル伝达経路に关和している.しかし、Rasがどのようにしてそれら多様な名タンパク性を选択しているかは明らかではない. In this study, the conditions on the artificial membrane and the conditions in the living body were compared, and the conditions on the environment were compared. The structure of the Toro system and the purpose of Ras's detailed function explanation. DOPCとNi-NTA-DOGSをmixedしてmadeしたliposomeを20mMCa^<2+> Under the conditions of fusion and electric furnace treatment, a lipid double film was successfully formed on the スライドガラス. His-tagをfusionさせたRasタンパク性を on the membraneで観看することにsuccessfulした. 1 molecule of observation, においては, タンパクquality, fixed されていることが看ましいが, Ann exinVえることで, membrane のタンパクquality の拡sanを inhibits することにsuccessした.さらに、non-specific binding のsensitivityしいRasのstandard タンパクqualityを、double membrane でproofぐことにより, Rasとstandard タンパク性との1対1のcombination and deviationの観看に成した.また、荍光LOGOしたRasと荍光性GTPアナログとのFRETを、ガラスとのInteractionにみだされることなく観草することに成した.そのRESULT, rasのstructuralはmsec~secの区でゆっくりと揺らいでいることがshows instigationされた. This research is based on the research on the quality of the film, the research on the quality of the film, and the research on the system. It's always useful, it's a good thing to do in the future, it's a positive thing to use, it's a good thing.

项目成果

Multiple forms of activated Ras observed directrly by single molecule FRET

单分子 FRET 直接观察到多种形式的活化 Ras

• 发表时间: 2003
• 期刊: Biophysical journal supplement 84
• 作者: Yoshiyuki Arai;Atsuko H Iwane;Tetsuichi Wazawa;Hiroaki Yokota;Tohru Kataoka;Yoshiharu Ishii;Toshio Yanagida
• 通讯作者: Toshio Yanagida

Y.Arai, H.Yokota, A.H.Iwane, T.Wazawa, T.Kataoka, Y.Ishii, T.Yanagida: "Ras takes multiple conformations to adapt to its multiple effectors"Biophysical Journal. 82(1). 452 (2002)

Y.Arai、H.Yokota、A.H.Iwane、T.Wazawa、T.Kataoka、Y.Ishii、T.Yanagida：“Ras 采用多种构象来适应其多种效应器”生物物理学杂志。

Yoshiyuki Arai, Atsuko H.Iwane, et al.: "Multiple forms of activated Ras observed directly by single molecule FRET"Biophysical Journal. 84. 37-37 (2003)

Yoshiyuki Arai、Atsuko H.Iwane 等人：“通过单分子 FRET 直接观察到多种形式的活化 Ras”生物物理学杂志。

Ras takes multiple conformations to adopt to its multiple effectors

Ras 采用多种构象来适应其多种效应器

• 发表时间: 2002
• 期刊: Biophysical journal supplement 82
• 作者: Yoshiyuki Arai;Hiroaki Yokota;Atsuko H.Iwane;Tetsuichi Wazawa;Tohru Kataoka;Yoshiharu Ishii;Toshio Yanagida
• 通讯作者: Toshio Yanagida

Y.Arai, A.H.Iwane, T.Wazawa, H.Yokota, Y.Ishii, T.Kataoka, T.Yanagida: "Multiple forms of activated Ras observed directly by single molecule FRET"Biophysical Journal. 84(2). 37 (2003)

Y.Arai、A.H.Iwane、T.Wazawa、H.Yokota、Y.Ishii、T.Kataoka、T.Yanagida：“通过单分子 FRET 直接观察到多种形式的活化 Ras”生物物理学杂志。