ヒト染色体の安定化機構を応用した長期持続的遺伝子発現システムの開発

利用人类染色体的稳定机制开发长期持续的基因表达系统

• 批准号: 02J20130
• 负责人: 岡部 潤
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J20130/
• 关键词: 染色体; 安定性; テロメア; TRF1; 不死化; 遺伝子治療; 安定化; 老化

1.動物細胞で遺伝情報の安定性を高感度に測定する系の開発ヒト細胞で染色体を含めた遺伝情報の安定性を高感度に測定する系を確立した。最初に、昨年度以前に作製した薬剤のポジティブ選択(抗生物質耐性遺伝子)とネガティブ選択(薬剤感受性遺伝子(自殺遺伝子))の2つの遺伝子マーカーをEBV(Epstein-Barr virus)の複製系に組み込んだ環状DNAを、この複製系が機能するために必須なEBNA1タンパクを発現させたヒト細胞に遺伝子導入した。次に目的のDNAが導入された細胞を選択するためにポジティブ選択を行い、その後、薬剤耐性細胞を薬剤非存在下で一定時間それぞれ培養した。最後に、それらの細胞を播種し、ネガティブ選択を行った。以上の過程において、1週間後に出現したコロニーは薬剤非存在下の期間で目的のDNAが失われた細胞と考え、DNA脱落率を測定した。その結果、以前ポジティブ選択のみで測定した報告(7-2%loss/generation)と一致しておりした。次に、ポジティブネガティブ選択遺伝子マーカーをヒト染色体に組み込ませ、染色体の安定性を測定した。その結果、染色体の脱落率は0.001-0.1%と著しく低く、非常に安定な染色体も短期間で簡単に測定できた。以上のことから、ポジティブネガティブ選択遺伝子マーカーを利用した遺伝情報の安定性を測定する実験法は非常に有用であることを証明し、現在国際雑誌に投稿中である。2.ヒトミニ染色体のテロメア領域の構造解析染色体の安定化に携わるテロメアの形成と維持のメカニズムを明らかにするために、ミニマーカー染色体に着目し、サザンブロッティングmappingとシーケンシング法によりこの染色体のテロメア領域の構造解析を行った。また、蛍光抗体法によりテロメアタンパク質の局在も検討した。その結果、ミニマーカー染色体のテロメア長は非常に短く、それに比例してテロメアタンパク質の局在も検出限界以下であった。現在、構造の詳細を解析中である。

1. The stability and stability of animal cells and the detection of high-sensitivity detection of chromosomes in cells have been established. The first one I made before last year was the した薬剤のポジティブ选択(antibiotic resistance legacy) とネガティブ选択( Epstein-Barr virus)'s replication system, the circular DNA, the function of the replication system, the function of the virus) must be maintained, and the EBNA1 system must be introduced into the cells. The target DNA is introduced into the cells of the target and the selected cells are selected. Afterwards, the cells that are resistant to the drug are cultured in the absence of the drug for a certain period of time. Finally, に、それらのcellを seedingし、ネガティブ选択を行った. The above process was carried out, and the appearance of the DNA after 1 week was measured during the period when the DNA was not present, and the DNA shedding rate was measured. The result is consistent with the previous measurement report (7-2% loss/generation) of the previous selection. The test of time, the selection of ポジティブネガティブselect択伝子マーカーをヒトchromosome groupみ込ませ, and the stability of chromosomes are measured. As a result, the shedding rate of chromosomes is 0.001-0.1%, the results are low, the chromosomes are extremely stable, and the chromosomes are measured in a short period of time. The above-mentioned のことから, ポジティブネガティブselect択伝子マーカーを utilize the した伝information's stability It has been proved that the method of determining the properties of the test is very useful, and it is currently being submitted to the International Journal of Journals. 2. Structural analysis of chromosomes in the field of ヒトミニのテロメア and stabilization of chromosomes The formation and maintenance of るテロメアののメカニズムを明らかにするために、ミニマーカーchromosome に目し、サザンブロッティングmappingとシーケンシング法によりこのchromosomeのテロメア区のstructural analysisを行った.また, 荍光antibody method によりテロメアタンパクqualityのbureau in も検した.そのRESULT, ミニマーカーchromosome, のテロメアlong, very short, く, それThe proportion of the してテロメアタンパクquality bureau is below the も検 limit. Now, the structure is being analyzed in detail.