金属錯体挿入による新規金属酵素の創製

通过插入金属配合物创建新的金属酶

• 批准号: 13740384
• 负责人: 上野 隆史
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Nagoya University (2002)Okazaki National Research Institutes (2001)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13740384/
• 关键词: 人工酵素; ミオグロビン; 蛋白質; 結晶構造; 触媒; ナノマテリアル; 超分子; 錯体; シッフ塩基; 酸化反応; クロム; 不斉反応; 金属蛋白質

人工酵素構築の新しい方法論として、蛋白質キャビティーに合成金属錯体を挿入し、蛋白質反応場を利用して反応制御をする試みは、当初の計画を大幅に上回る成果を生み出すことが出来たので、ここにまとめる。1.金属錯体挿入法の確立 初期の段階における、反応条件や挿入金属錯体の決定は多数のサンプルスクリーニングが必要となる。本研究では、ESI-TOF MSによる迅速スクリーニング法を確立し、数百にのぼるサンプルの解析から、安定な複合体の決定に成功した(投稿準備中)。2.人工金属酵素の構造決定 反応制御をおこなう上で、構造決定は重要である。本研究では安定な複合体を形成するM(3,3'-Me_2-salphen)・apo-A71G Mb (M=Cr^<III>, Mn^<III>, and Fe^<III>)の結晶構造解析に成功し、当初の分子設計通りに錯体がミオグロビンキャビティーに挿入され、特異的な非共有結合相互作用によって固定化されていることを明らかとした(投稿準備中)。3.反応制御方法の確立 結晶構造解析を元に、蛋白質反応場の分子設計を支援計算ソフトInsightII/Discover3によっておこない、蛋白質アミノ酸特異的部位置換法と挿入錯体の配位子をデザインすることによって、酵素反応の向上を目指した。具体的にはCr(3,3'-Me_2-salphen)・apo-A71G Mbの結晶構造をもとに、Cr(5,5'-t-Bu_2-salphen)・apo-H64D/A71G Mbを単離し、チオアニソールの不斉酸化反応に成功した。本研究は、合成錯体を非共有結合的に蛋白質に結合し、合理的な分子設計により反応制御をおこなった世界で最初の例である(Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1005)。4.今後の展望 本研究で得られた結果は、様々な金属化合物と蛋白質の複合化に利用できる。実際、生体分子の複合体システムに金属化合物を組み込んだり、蛋白質の内部で金属錯体を合成することによって、これまでにない、化学反応システムの構築を進行中である。

作为构建人工酶的新方法，尝试将合成金属复合物插入蛋白质腔中，并使用蛋白质反应场控制反应能够产生远远超过原始计划的结果，因此我们在此处将它们汇总。 1。在早期阶段建立金属复合物插入方法，确定反应条件和插入金属络合物需要大量样品筛选。在这项研究中，我们使用ESI-TOF MS建立了一种快速筛选方法，并通过对数百个样品的分析（准备发布）成功确定了稳定的复合物。 2。在控制反应时，人工金属酶结构的结构确定很重要。在这项研究中，我们成功地分析了M（3,3'-Me_2-Salphen）和Apo-A71G MB的晶体结构（M = Cr^<iii>，Mn^<iiii>和Fe^<iiii>），它们形成了稳定的复合物，并揭示了该络合物的特定目的是由Myoglob cavity插入的，并且是由分类插入的，并且是由分类插入的。 （准备发布）。 3。建立基于晶体结构分析的反应控制方法，我们旨在通过使用支持计算的软件Insighii/Discover3以及设计蛋白氨基酸特异性位点取代方法和插入配体的蛋白质氨基酸特异性位点取代方法，以改善酶反应。具体而言，分离了基于CR（3,3'-ME_2-SALPHEN）和APO-A71G MB的晶体结构，分离出CR（5,5'-T-BU_2-盐）和APO-H64D/A71G MB的晶体结构，并成功地携带了甲异异异烷的不对称氧化。这项研究是世界上第一个通过合理的分子设计与蛋白质与蛋白质结合并控制反应的第一个研究（Angew。Chem。Int。d。，2003，42，1005）。 4。未来的前景从这项研究中获得的结果可用于结合各种金属化合物和蛋白质。实际上，我们目前正在通过将金属化合物纳入生物分子复合物系统并合成蛋白质中的金属络合物来构建前所未有的化学反应系统。

项目成果

Hara I., Ueno T., Ozaki S., Itoh S., Lee K., Ueyama N., Watanabe Y.: "Oxidative Modification of Tryptophan 43 in the Heme Vicinity of the F43H/H64L Myoglobin Mutant"J. Biol. Chem. 276. 36067-36070 (2001)

Hara I.、Ueno T.、Ozaki S.、Itoh S.、Lee K.、Ueyama N.、Watanabe Y.：“F43H/H64L 肌红蛋白突变体血红素附近色氨酸 43 的氧化修饰”J。

Shigeru Kato, Hui-jun Yang, Takafumi Ueno, Shin-ichi Ozaki, George N. Phillips, Jr., Shunichi Fukuzumi, Yoshihito Watanabe: "Asymmetric Sulfoxidation and Amine Binding by H64D/V68A and H64D/V68S Mb : Mechanistic Insight into the Chiral Discrimination Step

Shigeru Kato、Hui-jun Yang、Takafumi Ueno、Shin-ichi Ozaki、George N. Phillips, Jr.、Shunichi Fukuzumi、Yoshihito Watanabe：“H64D/V68A 和 H64D/V68S Mb 的不对称磺化和胺结合：机制洞察

I.Hara, T.Ueno, S.Ozaki, S.Itoh, K.Lee, N.Ueyama, Y.Watanabe: "Oxidative Modification of Tryptophan 43 in the Heme Vicinity of the F43W/H64L Myoglobin Mutant"The Journal of Biological Chemistry. 276. 36067-36070 (2000)

I.Hara、T.Ueno、S.Ozaki、S.Itoh、K.Lee、N.Ueyama、Y.Watanabe：“F43W/H64L 肌红蛋白突变体血红素附近色氨酸 43 的氧化修饰”生物学杂志

Masataka Ohashi, Tomomi Koshiyama, Takafumi Ueno, Manabu Yanase, Hiroshi Fujii, Yoshihito Watanabe: "Preparation of Artificial Metalloenzymes by Insertion of Chromium(III) Schiff Base Complexes into Apo-Myoglobin Mutants"Angew. Chem. Int. Ed.. 42. 1005-10

Masataka Ohashi、Tomomi Koshiyama、Takafumi Ueno、Manabu Yanase、Hiroshi Fujii、Yoshihito Watanabe：“通过将铬 (III) 席夫碱配合物插入 Apo-肌红蛋白突变体中制备人工金属酶”Angew。