植物遺伝子機能解析のためのハイブリッド型リボザイムの開発

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(1)植物体内で高活性を示すハイブリッドリボザイム発現ベクターの開発哺乳類細胞で機能するリボザイムの設計方法をもとにして、植物のtRNA遺伝子、mRNA上をスライディングするタンパクと相互作用するアプタマー配列をハイブリッドさせたリボザイムを作成を行った。tRNAの高次構造を壊さないこと、最適なアプタマーの選択、バルジ構造やステム構造の導入あるいは削除によって安定性、活性の調節を行うことを試みた。(2)植物体内で高活性を示すリボザイムのスクリーニング系開発標的mRNAがどの程度破壊されたのかを測定するための植物培養細胞(タバコBY-2)システムを構築する。BY-2培養細胞は増殖が速く、均一な細胞が得られやすく、多種類のリボザイムの候補をスクリーニングするのに適している。エレクトロポレーションを用いたトランジェントアッセイと、アグロバクテリウムによって安定的に形質転換した細胞を用いたリボザイム活性測定を行う。まず、トランジェントアッセイ行って、デュアルルックシステムを用いて迅速にリボザイムの候補を絞った後、安定的に形質転換したリボザイムを用いて、形質転換体における効果を調べる。BY2への遺伝子導入方法を確立した。(3)形質転換植物体におけるリボザイムの機能解析植物体におけるリボザイムの機能解析を行う。モデル植物であるシロイヌナズナ、タバコに導入した形質転換植物体を作成する。サイレンシングにより表現型が現れる既知の遺伝子を標的にするリボザイムを設計し、生体内におけるリボザイムの発現効率、安定性、活性などを解析することにより植物体内におけるリボザイムの最適化を試みた。リボザイムは標的を効率的に切断しないようであった。その原因については現在解明中である。