吸血性ダニ由来新規抗凝血物質に関する研究

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吸血性ダニ唾液腺より見い出した7種のKunitz型プロテアーゼ阻害剤を大腸菌を用いて発現し、抗凝血活性を測定した。その結果、1種のKunitz型プロテアーゼ阻害剤に顕著な抗凝血活性があることを見い出した。このKunitz型プロテアーゼ阻害剤はActivated Partial Thrombin Time (APTT)およびProthrom bin Time (PT)のいずれも延長し、内因および外因系血液凝固反応を阻害することが明らかになった。APTTおよびPT測定の結果からAPTTの方に強く作用することが判明したので、血液凝固内因系の標的プロテアーゼの同定を試みた。まず内因系に関与する全てのプロテアーゼとその合成基質を用いて阻害活性測定を行った結果、いずれのプロテアーゼ活性も阻害しないことが確認された。次に全てのプロテアーゼとの相互作用を表面プラスモン共鳴法により測定した結果、XIIa因子と特異的に結合することが明きらかになった。さらにZn^<2+>イオン存在下ではXIIa因子に加えて、XII因子および高分子キノノゲンとも結合することが確認された。以上の結果よりこのKunitz型プロテアーゼ阻害剤の標的分子はXII/XIIa因子および高分子キニノゲンであることが明きらかとなった。次にKunitz型阻害剤と標的分子間との相互作用に対するZn^<2+>イオンの影響を調べた。その結果、Zn^<2+>イオンの濃度変化に伴って結合が大きく変化することが明きらかとなった。XII/XIIa因子および高分子キニノゲンはZn^<2+>イオンが結合すると構造変化することが報告されていることから、このKunitz型阻害剤はこれらの分子のZn^<2+>イオンによる構造変化を認識して結合していることが明きらかとなった。また、このKunitz型阻害剤はXII/XIIa因子および高分子キニノゲンの異物結合ドメインと結合することが明きらかとなった。さらにこれらの標的分子は内因系血液凝固反応の初期段階に位置する接触相を構成する分子であることから、このKunitz型阻害剤の接触層に対する影響を調べた。その結果、Kunitz型阻害剤は濃度依存的に接触相の活性化を阻害することが明きらかとなった。以上の結果よりこのKunitz型阻害剤は接触相の活性化を阻害することで強力な内因系凝固阻害を引き起こすことが明きらかとなった.