食品タンパク質の経口投与により誘導される不応答化T細胞の特性の分子生物学的解析

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1)不応答化T細胞に特異的に発現する遺伝子の探索抗原の経口投与により誘導された不応答化T細胞とコントロールT細胞(抗原の非経口投与により誘導されたT細胞)間でsubtractive hybridization法を行うことにより、不応答化T細胞に特異的に発現する遺伝子クローニングした。Differential screeningを行うことにより、擬陽性クローンを排除した。候補クローンについては塩基配列の解析を行った。さらに定量的RT-PCR法を行うことにより、候補クローンの発現特異性について検討し、候補の絞り込みを行った。現在、候補クローンについて全長cDNAのクローニングを行っているところである。2)不応答化T細胞の抗原認識とシグナル伝達不応答化T細胞を抗原/抗原提示細胞で刺激し、raftにおけるシグナル伝達について検討した。すなわちT細胞を非イオン性界面活性剤であるBrij98で可溶化した後、ショ糖密度勾配遠心法によりraft画分を分離した。raft画分に含まれるシグナル伝達分子についてはwestern blotting法により解析した。その結果、コントロールT細胞においては抗原刺激依存的にraftに局在するT細胞レセプター(TCR)、ZAP70、LATなどのシグナル伝達分子の量が増加するのに対し、不応答化T細胞ではこれらシグナル伝達分子の量の増加は認められなかった。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いてTCR、raftマーカーGM1の細胞膜上の局在を調べたところ、コントロールT細胞とは異なり、不応答化T細胞ではTCRやGM1が抗原提示細胞との接触面に局在しているものが少なかった。以上より、不応答化T細胞はraftの局在、raftにおけるシグナル伝達制御に障害があることが示された。