キサンチン酸化酵素のモリブデン配位子の構造と機能

1.酵素のX-線結晶解析による構造解析ミルク酵素を前年までに結晶化させたが、結晶がX-線に弱いこと、結晶そのものが単結晶としての性質がないなどの問題点があった。本年度結晶化の吟味と筑波高エネルギー研究所のサイクロトロンを使用することにより問題がほぼ解決し、space groupを求めるのに成功した。現在重金属置換法を検討中である。2.キサンチン酸化酵素の硫黄配位子合成機構の検討メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素を精製し、その部分アミノ酸配列を決めた。そのクローニングを試みたが、量が少ないためクローンをとるまでには至らなかった。しかし、アミノ酸配列がロダネーゼと極めて類似しているので、そのcDNAクローンを得、それを改変して転移酵素を作成中である。3.キサンチン酸化酵素cDNAの酵素蛋白発現系の開発前年までに開発系の確立に既に成功している。本年その発現酵素の精製とその分析を行った。発現酵素は二つの分画に分離され、一方は活性のないデモリブド型であったが、一方は活性のある型であった。その性質を詳細に検討した。さらに天然酵素からモリブデンコファクターを抽出し、デモリブド型を再構成するのをここみたが、結果は常には成功しない。その原因を追求するとともに、モリブデンコファクターの精製を試みその構造決定を行いつつある。4.パルスラジオリシスによるキサンチン脱水素酵素の反応機構解析(2班小林一雄博士との共同研究)キサンチン脱水素酵素の分子内電子伝達機構を明らかにした。従来分子内電子伝達はMo→Fe/S→FADと考えられてそれが定説となっていたが、新しいラジカルを用いその定説と異なる結果が得られた(Mo→FAD【double half arrows】Fe/S)。それは、今までの様子な実験結果とも合致し、この酵素の反応機構に新しい視点を与えるものとなった。またこの酵素の非ヘム鉄の役割についても新しい視点が

1.酵素のX-線結晶解析による構造解析ミルク酵素を前年までに結晶化させたが、結晶がX-線に弱いこと、結晶そのものが単結晶としての性質がないなどの問題点があった。本年度結晶化の吟味と筑波高エネルギー研究所のサイクロトロンを使用することにより問題がほぼ解決し、space groupを求めるのに成功した。現在重金属置換法を検討中である。2.キサンチン酸化酵素の硫黄配位子合成機構の検討メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素を精製し、その部分アミノ酸配列を決めた。そのクローニングを試みたが、量が少ないためクローンをとるまでには至らなかった。しかし、アミノ酸配列がロダネーゼと極めて類似しているので、そのcDNAクローンを得、それを改変して転移酵素を作成中である。3.キサンチン酸化酵素cDNAの酵素蛋白発現系の開発前年までに開発系の確立に既に成功している。本年その発現酵素の精製とその分析を行った。発現酵素は二つの分画に分離され、一方は活性のないデモリブド型であったが、一方は活性のある型であった。その性質を詳細に検討した。さらに天然酵素からモリブデンコファクターを抽出し、デモリブド型を再構成するのをここみたが、結果は常には成功しない。その原因を追求するとともに、モリブデンコファクターの精製を試みその構造決定を行いつつある。4.パルスラジオリシスによるキサンチン脱水素酵素の反応機構解析(2班小林一雄博士との共同研究)キサンチン脱水素酵素の分子内電子伝達機構を明らかにした。従来分子内電子伝達はMo→Fe/S→FADと考えられてそれが定説となっていたが、新しいラジカルを用いその定説と異なる結果が得られた(Mo→FAD【double half arrows】Fe/S)。それは、今までの様子な実験結果とも合致し、この酵素の反応機構に新しい視点を与えるものとなった。またこの酵素の非ヘム鉄の役割についても新しい視点が